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膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,手术治疗后仍有较高的复发率。现阶段,如何有效地治疗膀胱癌并预防复发依然是基础和临床研究的重点和难点问题。RNA干扰现象被认识已有10年左右时间,但到目前为止,未发现哺乳动物有内源表达的小干扰RNA(siRNA)。一些研究者采用体外化学合成的方法获得siRNA来进行肿瘤治疗的研究,siRNA在细胞内作用时间较为短暂,适用于研究瞬时效应,不宜用来长期观察RNA干扰后细胞生物学功能的变化。能够表达短发夹结构RNA(shRNA)的真核表达质粒可以克服siRNA作用时间短暂的缺点,研究者通过脂质体等辅助转染方法将质粒转入肿瘤细胞内,质粒在细胞内长时间表达shRNA,短发夹结构RNA在细胞浆内被Dicer酶切割加工成siRNA后发挥RNA干扰作用。近年来,RNA干扰技术为研究膀胱癌提供了一个全新的途径。恶性增殖是癌细胞的主要特征之一,长期以来,增殖细胞核抗原(PCNA)仅仅是用来判定包括膀胱癌在内的许多肿瘤恶性增殖程度和不良预后的标志物,很少有研究者将PCNA直接与恶性肿瘤的治疗联系在一起,将PCNA基因作为小干扰RNA治疗膀胱癌的靶基因国内外文献未见有报道。本课题设计思路:首先,体外化学合成siRNA,通过脂质体包裹后转染膀胱癌细胞,研究siRNA瞬时mRNA干扰效果以及对膀胱癌细胞生物学行为的影响,再根据siRNA的序列构建shRNA真核表达质粒载体,进一步研究shRNA表达质粒持久mRNA干扰效果以及对膀胱癌生长的影响,旨在通过检测靶向PCNA基因的siRNA(PCNA-siRNA)和shRNA(PCNA-shRNA)在体内外抑制膀胱癌生长的效果为治疗膀胱癌并预防复发作出一些积极有益的探索。本研究分四个部分。第一部分:靶向PCNA基因的有效siRNA序列的筛选目的:设计并筛选出靶向PCNA基因的有效siRNA序列,为后续研究提供依据。方法:针对人类PCNA基因mRNA(NM-002592)序列设计并化学合成三条siRNA。选择100nM作为siRNA的最佳终浓度,在siRNA转染后24、48、72和96小时用荧光定量RT-PCR(RTq-PCR)检测T24细胞PCNA-mRNA表达水平的变化;在siRNA转染后72小时用western-blotting检测T24细胞PCNA蛋白表达水平的变化。结果:3条PCNA-siRNA在转染后48小时干扰效果最好,mRNA抑制率均在80%以上,其中PCNA-siRNA3抑制效果最好,mRNA抑制率高达90.2±1.7%。PCNA蛋白表达和mRNA表达水平的变化趋势一致。结论:PCNA-siRNA1(靶位点291-309)、PCNA-siRNA2(靶位点550-568)和PCNA-siRNA3(靶位点679-697)均为有效序列。PCNA-siRNA3干扰效果最好。第二部分:靶向PCNA基因的siRNA抑制膀胱癌生长的体外实验研究目的:探讨PCNA基因表达瞬时抑制后T24细胞生物学行为的变化。方法:选择干扰效果最好的PCNA-siRNA3来抑制膀胱癌T24细胞PCNA基因的表达,在PCNA基因表达抑制后用MTT检测T24细胞生长抑制率,DAPI染色检测T24细胞凋亡,FCM检测T24细胞周期和凋亡,Transwell体外侵袭实验检测T24细胞体外侵袭能力。结果:在转染后第1、2、3、4、5天T24细胞生长抑制率,干扰组分别为23.7±2.8%、70.8±0.7%、69.8±0.4%、48.8±0.3%、31.7±0.2%,阴性对照组分别为2.4±0.9%、3.9±0.1%、5.8±0.6%、12.2±0.4%、8.1±0.1%,干扰组T24细胞生长抑制率明显高于阴性对照组,以第2、3天效果最佳(p值均＜0.05);在转染后第3天,干扰组多数视野可见少量的凋亡细胞,而空白对照组、阴性对照组视野内几乎看不到凋亡细胞,流式细胞仪检测干扰组细胞凋亡率为7.4±0.6%,较空白对照组和阴性对照组明显增加(p值均＜0.05),干扰组有更多的细胞被阻滞在S期和G1期(p值均＜0.05);在转染后第3天,Transwell体外侵袭实验显示:空白对照组、阴性对照组、干扰组穿过滤膜的细胞数分别为95±7、90±8和为20±2。干扰组穿过滤膜的细胞数较空白对照组和阴性对照组少(p＜0.05)结论:PCNA-siRNA3有效地抑制了T24细胞增殖,在转染后第2、3天抑制能力最强;在转染后第3天,PCNA-siRNA3促进了T24细胞凋亡并有效地抑制了T24细胞体外侵袭能力,干扰组有更多的细胞被阻滞在S期和G1期。第三部分:靶向PCNA基因的有效shRNA真核表达质粒的构建、鉴定和筛选目的:构建靶向PCNA基因的有效shRNA真核表达质粒,为体内研究提供依据。方法:根据PCNA-siRNA1～3序列构建pGPU6/GFP/Neo-PCNA-shRNA1～3真核表达质粒。质粒启动子为U6,含抗性筛选标记Neomycin同时可以表达绿色荧光蛋白。所得质粒用BamHI,PstⅠ分别酶切鉴定。委托上海英骏生物技术有限公司进行测序鉴定。通过G418筛选提高T24细胞质粒转染效率,筛选后2周后获得多克隆T24细胞,用荧光定量RT-PCR(RTq-PCR)检测多克隆T24细胞PCNA-mRNA表达,用western-blotting检测多克隆T24细胞PCNA蛋白表达,选定有效shRNA真核表达质粒。结果:pGPU6/GFP/Neo-PCNA-shRNA1～3真核表达质粒均为阳性重组载体且测序正确。筛选2周后质粒转染效率＞50%。T24-PCNA-shRNA3多克隆细胞PCNA-mRNA的表达抑制率达47.0±1.9%,明显高于阴性对照组T24-shNC多克隆细胞的1.8±0.7%。(p＜0.05)。PCNA蛋白表达水平与mRNA表达水平的变化趋势一致。结论:成功构建pGPU6/GFP/Neo-PCNA-shRNA1～3真核表达质粒,pGPU6/GFP/Neo-PCNA-shRNA3持续有效地抑制了T24细胞PCNA基因的表达。第四部分:靶向PCNA基因的shRNA抑制膀胱癌生长的体内实验研究目的:探讨PCNA-shRNA3真核表达质粒在体内抑制膀胱癌生长的情况。方法:1、在右侧胁腹部建立荷人膀胱癌BALB/c裸鼠移植瘤模型。裸鼠随机分成3组,每组6只,分别为未处理组(瘤内未注射)、阴性对照组(瘤内注射shNC质粒20ug/鼠)和处理组(瘤内注射PCNA-shRNA3质粒20ug/鼠)。在接种T24细胞后第8、10、13、16、19、22、25天注射,共7次。于接种后第28天以断颈法处死所有裸鼠。2、筛选PCNA-shRNA3相对稳定表达T24多克隆细胞,在BALB/c裸鼠右侧胁腹部接种PCNA-shRNA3相对稳定表达T24多克隆细胞,接种后第28天以断颈法处死所有裸鼠。测量肿瘤体积,肿瘤组织作常规HE染色和免疫组织化学染色。结果:1、未处理组和阴性对照组肿瘤生长较快,接种T24细胞后第28天,肿瘤表面张力大,有破溃的迹象,瘤体平均体积分别为761.3±149.9 mm~3和718.3±75.1mm~3,处理组肿瘤生长速度较慢,肿瘤表面无破溃的迹象,瘤体平均体积328.1±150.1mm~3。未处理组和阴性对照组相比差别无统计学意义(p＞0.05),处理组与未处理组、阴性对照组相比差别均具有统计学意义(p值均＜0.05)。2、多克隆细胞组接种后第28天,4只裸鼠有肉眼可见肿瘤,最大直径约4mm,2只未出瘤。4只裸鼠瘤体平均体积为6.8±1.6mm~3,较未处理组明显小(p＜0.05)。3、PCNA蛋白表达从强到弱依次为:未处理组与阴性对照组、处理组、多克隆细胞组(p值均＜0.05)。结论:1、PCNA-shRNA3真核表达质粒持续有效地抑制了T24细胞皮下成瘤能力。2、PCNA-shRNA3真核表达质粒有效抑制了荷瘤裸鼠膀胱癌的生长。