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登革热病毒(Dengue virus, DENV)是一种蚊媒病毒,在超过100多个国家中,尤其是亚洲和拉丁美洲,引起了巨大的公共卫生问题。据估计,每年有超过5千万至1亿人感染登革热病毒。随着其宿主埃及伊蚊和白纹伊蚊栖息地的扩张,全球面临越来越严重的登革感染风险。四型登革病毒中每一型单独感染均能导致一系列程度不一的临床症状,从自限性的登革热(DF)至危及生命的登革出血热(DHF)或登革休克综合症(DSS)等重症形式。基于临床观察,二次异型感染或登革患者胎儿随年龄增长均显著增加重症感染几率,抗体依赖增强假说(ADE)被提出以解释登革病毒重症感染病理机制。该理论认为,在二次异型登革病毒感染中预先存在的交叉抗体能够与病毒结合,通过抗体与靶细胞表面Fc受体的相互作用促进病毒对单核细胞,巨噬细胞,以及成熟DC细胞的感染。目前研究认为DENV-ADE能够通过抑制Ⅰ型干扰素产生及效应进而促进病毒增殖；其中抗炎症细胞因子,如IL-10等对干扰素途径的抑制作用在DENV-ADE感染中扮演的重要角色。然而有研究证明DENV-ADE感染的人初始单核细胞并不抑制干扰素或IL-10表达。这些研究显示DENV-ADE感染Fc受体阳性细胞存在一种更为普遍的机制,且不依赖于上调IL-10对一型干扰素抑制过程。在本研究中,我们使用Ⅰ型干扰素缺陷细胞K562建立了DENV3抗体依赖增感染体外模型,并体现出内部增强感染形式。通过检测抗病毒基因NOS2表达水平,发现DENV-ADE感染细胞中降低的NOS2表达及NO活性分子释放导致了病毒胞内复制增加。进一步分析NOS2基因上游调控途径,发现DENV-ADE感染中下调的NOS2基因表达源于固有免疫RIG-I/MDA-5—NF-κB—IRF-1信号途径抑制。过表达RIG-I和/或MDA-5能够协同促进NF-κB活化及NOS2表达。为验证免疫抑制因子IL-10在DENV-ADE固有免疫抑制中的作用,我们检测了IL-10/IL-6—SOCS3通路,发现DENV-ADE感染K562细胞未显著上调IL-10, IL-6, SOCS3表达。利用CRISP/CAS9技术获得IL-10敲出的K562细胞进行DENV-ADE模型表明,IL-10并不影响DENV-ADE感染。由于细胞自噬过程在DENV复制中扮演重要作用,我们比较了DENV直接感染与DENV-ADE感染中自噬程度差异。研究发现,DENV-ADE感染K562细胞诱导更高水平的自噬体形成及自噬相关蛋白ATG5, ATG12表达。通过药物促进或抑制细胞自噬进程能够剂量依赖性地促进或抑制胞内病毒复制,且完全敲除自噬相关蛋白ATG5显著抑制胞内病毒复制。结果表明,DENV-ADE感染通过诱导更强的自噬进而促进胞内病毒增殖。此外,过表达自噬蛋白ATG5能够通过抑制NF-κB活化及NOS2表达从而促进病毒增殖。本研究发现DENV-ADE感染中病毒复制增强是由RIG-I/MDA-5—NF-κB— IRF-1—NOS2固有免疫途径抑制导致的,且该抑制过程不依赖于IL-10—SOCS3对干扰素途径的抑制。此外DENV-ADE感染能够通过上调细胞自噬进程,抑制固有免疫途径,从而促进病毒增殖。该研究将有助于加深我们对DENV-ADE感染机制的理解,并为重症登革患者治疗提供了理论支持和潜在靶点,同时也表明自噬抑制剂在治疗DENV-ADE引起的重症登革热疾病,以及抑制病毒胞内复制方面具有潜在的应用价值。