研究背景目前,国内外支气管哮喘患病率逐渐上升,全世界支气管哮喘患者约有1亿人,已成为严重威胁人们健康的主要慢性疾病,而其发病机制尚未完全阐明。近年来,TH1/TH2平衡理论一直作为支气管哮喘发病机制的核心。但是,研究表明,除外Th1和Th2细胞外,可能还存在着一个功能和细胞因子产生方面既不同于Thl也不同于Th2的T细胞亚型,称为调节性T细胞(regIllatory Tcel1, Tr)。调节性T细胞主要包括：分泌高水平IL-10的Trl、分泌TGF-β为主的TH3及CD8+和CD4+调节性T细胞。在免疫调节过程中,CD4+调节性T细胞促发抑制作用的发生,而CD8+调节性T细胞是发挥抑制作用的效应细胞。在CD8+调节性T细胞中,CD8+CD28调节性T细胞是的主要亚群,约占90%,其可抑制抗原提呈细胞共刺激分子CD80、CD86、CD54、CD58的表达。此外,该细胞也可抑制辅助性T细胞NF-KB(核因子kB)的激活、抑制共刺激分子的转录、阻止辅助性T细胞膜上CD40L分子的表达、抑制辅助性T细胞对MHC-Ⅰ类分子抗原的反应活性。越来越多的证据表明,CD8+CD28-调节性T细胞与哮喘变态反应性炎症及外周维持机体自身免疫耐受有着一定的关系。上调哮喘患者CD8+CD28-调节性T细胞数量或功能、纠正其免疫失调或将成为哮喘治疗的新策略。髓系来源抑制性细胞(Myeloid derived suppressor cells MDSC)为近年来研究发现在肿瘤患者体内聚积的一类与肿瘤免疫逃逸密切相关的髓样细胞,由不同分化阶段的髓系细胞如单核细胞、粒细胞、未成熟细胞等组成。最早于1970年,意大利肿瘤学家利用肿瘤疫苗进行防治肿瘤的研究,结果发现此种肿瘤疫苗对于肿瘤的生长没有抑制作用。十余年后,他们在美国继续这项研究时发现在肿瘤动物中存在具有免疫抑制作用的细胞—MDSC。90年代末,Gabrilovich等在研究为何肿瘤疫苗不能阻止肿瘤组织生长时,发现肿瘤动物的脾脏中存在MDSC,此细胞群超过40%,比正常人群高3-5倍,而树突状细胞的数量则明显下降。MDSC还可在荷瘤小鼠体内诱导调节性T细胞Foxp3的表达,上调CD4+、CD8+调节性T细胞的比例,引起免疫无能和抑制。研究发现MDSC的免疫抑制功能与其来源有关,往往只有从患瘤鼠或肿瘤患者体内分离到的这类细胞才具有免疫抑制功能,而用同样方法从正常鼠或人分离的同类细胞则不具有抑制功能。近年来,MDSC已经成为自身免疫疾病、肿瘤、器官移植等疾病领域研究的热点问题。然而,其细胞特性、免疫调节功能及其在哮喘中作用研究较少。本实验以荷瘤小鼠为研究对象,采用二次磁珠分离法来分离,纯化,体外培养活化的MDSC,并通过过继转移MDSC直接十预哮喘动物的气道炎症反应,检测小鼠外周血CD8+CD28-T细胞比例。观察MDSC是否可以干预哮喘发作,同时观察MDSC对CD8+调节性T细胞的调控,探讨可能的作用机制。第一部分小鼠哮喘模型建立目的建立OVA致敏和激发的雌性BALB/c小鼠哮喘模型方法SPF级雌性BALB/c小鼠(南方医科大学实验动物中心)20只,4-6周龄,体重18-20g,随机分为2组,每组10只,A组为正常对照组,B组为哮喘模型组。B组小鼠于实验流程第0、14d、21d给予腹腔注射含OVA2mg和乳化氢氧化铝5mg的生理盐水混悬液200μl致敏；第28d开始先给予1%OVA生理盐水200μl滴鼻激发,随后给予2%OVA生理盐水雾化液40ml经超声雾化器雾化吸入,每天1次,每次持续约30min,连续7d。A组以生理盐水替代致敏液及雾化液,方法同B组。诱发小鼠哮喘后第7天,摘取小鼠眼球放血后处死,两组小鼠各随机选取6只行支气管肺泡灌洗术。将回收的BALF涂片,固定,HE染色,光学显微镜下计数支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数及嗜酸性粒细胞数,中性粒细胞数。两组小鼠各自随机选取4只行开胸取肺组织,置于10%中性甲醛固定液中固定。常规取材、脱水、石蜡包埋、制备石蜡切片、HE染色、中性树胶封片,光学显微镜下观察组织形态、气道上皮损伤、气管及血管周围嗜酸性粒细胞浸润情况。结果1.致敏、激发过程小鼠行为学观察：模型组小鼠出现不同程度的扭体反应、立毛,头面部瘙痒,前肢搔鼻,烦躁不安,然后俯伏不动,口唇紫绀,呼吸急促,腹肌抽搐,二便失禁等症状；而正常组小鼠无此阳性症状。2. BALF中细胞总数和分类比较：①BALF细胞总数：A组BALF细胞总数为(6.75±52.70)×104/ml,B组BALF细胞总数为(34.05±8.62)×104/ml,B组BALF细胞总数显著高于A组(t=-9.557,P=0.006)。②BALF(?)耆酸性粒细胞：A组和B组BALF(?)耆酸性粒细胞数分别为(1.35±0.96)×104/ml和(10.85±3.14)×104/ml,B组BALF(?)耆酸性粒细胞数显著高于A组(t=-8.378,P=0.004)。③BALF中性粒细胞数：A组和B组BALF中性粒细胞数分别为(1.56±0.82)×104/ml和(9.78±2.65)×104/ml,B组BALF中性粒细胞数显著高于A组(t=-9.450,P=0.002)。3.肺组织病理变化：哮喘模型组支气管及血管周围大量炎性细胞浸润,肺间质及肺泡腔内可见中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润,可见气道上皮损伤、结构紊乱、气道内杯状细胞肥大增生,气道内分泌大量黏液并有粘液栓形成,粘膜下胶原纤维沉积。对照组肺组织气道结构清晰,气道纤毛上皮排列整齐,无明显的炎症改变及胶原纤维沉积。结论雌性BALB/c小鼠经OVA和乳化的氢氧化铝腹腔注射致敏后,采用滴鼻联合雾化激发的方法成功建立小鼠哮喘模型,更加符合哮喘气道的病理生理改变。第二部分MDSC对哮喘小鼠气道炎症的影响及CD8+CD28调节性T细胞的调控作用目的观察MDSC对哮喘小鼠气道炎症的影响及CD8+CD28-调节性T细胞的调控作用,探讨可能的机制方法SPF级BALB/c小鼠35只,其中6周龄雄鼠5只,用于制备髓系来源抑制性细胞：6周龄雌鼠30只,随机分为正常对照组(A组)、哮喘组(B组)细胞移植组(C组),10只/组。采用免疫磁珠技术分选肿瘤小鼠骨髓中的MDSCs,在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的诱导下外扩增培养,通过倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞术检测其表型及其表达率。B、C两组予OVA腹腔注射致敏、OVA雾化诱发哮喘,C组在诱导哮喘的第10天经尾静脉注入免疫磁珠分选提纯的髓源性抑制细胞。HE染色观察小鼠肺部病理改变,计数支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数及嗜酸性粒细胞数、中性粒细胞数。流式细胞术检测小鼠外周血中CD8+CD28-调节性T细胞占淋巴细胞的百分比,分析C组BALF中嗜酸性粒细胞与外周血中CD8+CD28调节性T细胞百分比的相关性结果1.小鼠行为学观察B组小鼠出现不同程度的扭体反应、立毛,头面部瘙痒,前肢搔鼻,烦躁不安,然后俯伏不动,口唇紫绀,呼吸急促,腹肌抽搐,二便失禁等症状：A组小鼠无此症状,C组小鼠偶有此症状。2. BALF中细胞总数及中性粒细胞数、嗜酸性粒细胞数比较BALF中细胞总数和分类比较：①BALF细胞总数：A组BALF细胞总数为(6.75±2.70)×104/ml,B组BALF细胞总数为(34.05±8.02)×104/ml,C组BALF细胞总数为(17.39±3.49)×104/ml,B和C组BALF细胞总数显著高于A组(P<0.01),C组明显低于B组(P<0.01)②BALF(?)(?)酸性粒细胞和中性粒细胞数：A组BALF(?)(?)酸性粒细胞和中性粒细胞数分别为(1.35±0.96)×104/ml和(1.56±0.82)×104/ml,B组BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数分别为和(9.78±2.65)×104/ml和(10.85±3.14)×104/ml,C组BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数分别为和(4.16±1.53)×104/ml和(6.99±2.07)×104/ml,B组和C组BALF嗜酸性粒细胞和中性粒细胞显著高于A组(P<0.01),C组嗜酸性粒细胞和中性粒细胞比例明显低于B组(P<0.01)。3.肺组织病理学变化A组小鼠：小气管上皮黏膜完整,周围肺组织基本无炎症细胞浸润。B组小鼠：支气管、血管黏膜下和周围肺组织有明显的炎症细胞浸润。以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞为主,可见杯状细胞增生。C组小鼠：与哮喘组相比,支气管、血管黏膜下和周围肺组织炎症明显减轻。4.流式细胞术检测外周血CD8+CD28—T细胞：哮喘组为(6.0±1.9)%,显著低于正常对照组的(11.1±3.8)%和细胞移植组(8.8±2.1)%,差异有统计学意义(F=11.791,P<0.05),细胞移植组与正常对照组之间差异无统计学意义(P=0.336)。5.细胞移植组小鼠BALF中EOS与外周血CD8+CD28-T细胞作Pearson相关分析示：细胞移植组BALF中嗜酸性粒细胞计数均与外周血中CD8+CD28—T细胞百分比呈显著负相(r=-0.709,P=0.022)。结论静脉输注荷瘤小鼠髓系来源抑制性细胞可上调哮喘小鼠外周血CD8+CD28调节性T细胞比例,并且一定程度上可抑制哮喘小鼠气道炎症。