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背景:在女性发生恶性肿瘤中,乳腺癌居于发病率和死亡率首位。临床上内分泌治疗对于激素受体阳性乳腺癌患者具有良好的治疗作用,但仍有部分乳腺癌患者在治疗过程中会产生耐药性。如何提高内分泌治疗敏感性、逆转耐药问题是乳腺癌内分泌治疗的热点之一。与正常组织细胞相比,肿瘤细胞主要通过消耗大量葡糖糖进行有氧糖酵解产生能量。研究表明,雌激素限制可诱导乳腺癌细胞出现自噬,这一显现与肿瘤细胞能量限制后激活的细胞死亡信号通路具有一定的相似性,在雌激素治疗的基础上,联合能量代谢抑制可能会对肿瘤治疗产生增效作用。目的:1.探究雌激素抑制后对乳腺癌细胞能量代谢的变化。2.探究雌激素与能量双重阻断对乳腺癌细胞增殖抑制、凋亡及自噬的影响。3.探究葡萄糖转运蛋白1抑制剂BAY-876联合他莫昔芬(TAM)在体内的抗肿瘤增效作用。方法:使用浓度梯度的他莫昔芬分别作用乳腺癌细胞MCF-7和T-47D两株细胞,检测对两株细胞24h、48h、72h的增殖抑制作用;检测TAM单药处理两株细胞后葡萄糖消耗率、ATP水平、乳酸产生量的差异。当敲低Glut1的表达时,使用浓度梯度的他莫昔芬分别作用两株乳腺癌细胞,观察乳腺癌细胞对他莫昔芬(TAM)的敏感性。根据24h的TAM单药IC50,葡萄糖转运蛋白1抑制剂BAY-876单药的IC50,选择低毒性的BAY-876和TAM药物浓度联合使用,将乳腺癌细胞MCF-7和T-47D分别于10μM TAM单药、20μM BAY-876单药、10μM TAM和20μM BAY-876联合用药分别处理24h,同无药物处理对照组相比细胞株的凋亡率、线粒体膜电位水平的差异;处理48h后,同无药物处理对照组相比,两株乳腺癌细胞的葡萄糖消耗率、线粒体膜电位水平、细胞亚显微结构的变化;处理6h后,同无药物处理对照组相比细胞株的ATP水平、ROS水平的变化;并分析两株乳腺癌细胞MCF-7和T-47D处理48h后PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白、凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白的表达情况。同时建立裸鼠移植瘤模型,检测BAY-876联合他莫昔芬的体内抗肿瘤作用。结果:1.TAM对乳腺癌细胞能量代谢的影响使用不同浓度的TAM(0,2.5,5,10,20,40μmol/L)在不同作用时间(24h,48h,72h)下对乳腺癌细胞MCF-7和T-47D的增殖抑制作用随着浓度和时间的提高而增加;当敲低Glut1表达时低浓度梯度的TAM(0,2.5,5,10μmol/L)作用于细胞24h显著抑制了细胞的增殖。低剂量的TAM会增加乳腺癌细胞对葡萄糖的消耗,但是5,10μmol/L的他莫昔芬对癌细胞的葡萄糖消耗并未显示出明显影响;而TAM单药作用乳腺癌细胞显著增加了细胞的乳酸生成量。2.BAY-876增强TAM对乳腺癌细胞的增殖抑制作用使用不同浓度的BAY-876(0,5,10,20,40,80μmol/L)在不同作用时间(24h,48h,72h)下对乳腺癌细胞MCF-7和T-47D的增殖抑制作用随着浓度和时间的提高而增加。根据24h BAY-876单药的IC50、TAM单药的IC50,各自选取一个低浓度的BAY-876 20μM、TAM10μM作用于两株乳腺癌细胞后,BAY-876联合TAM作用下细胞的增殖抑制作用表现出进一步增强,并且联合给药作用后肿瘤组织中的Ki67和PCNA的表达明显降低。3.BAY-876增强TAM对乳腺癌细胞死亡率的影响使用BAY-876、TAM、BAY-876&TAM分别作用于乳腺癌细胞MCF-7和T-47D后,与单独使用BAY-876、TAM处理组相比,BAY-876联合TAM组的细胞核固缩明显,胞膜皱缩,细胞核碎裂等凋亡形态学特征也明显增多。Annexin V-FITC法的实验结果显示,BAY-876联合TAM明显诱导乳腺癌细胞MCF-7和T-47D的死亡率。Western blot结果同样验证了这一结果,即与单独给药组相比,BAY-876&TAM处理组的促凋亡蛋白Bax,PARP,其表达量升高;抗凋亡蛋白Bcl-2表达量明显降低。4.BAY-876联合TAM对乳腺癌细胞MCF-7和T-47D能量代谢的影响使用BAY-876、TAM、BAY-876&TAM分别作用于乳腺癌细胞MCF-7和T-47D后,与BAY-876、TAM单药相比,BAY-876联合TAM作用于乳腺癌细胞MCF-7和T-47D后,细胞对葡萄糖的摄取显著减少,进而降低细胞内ATP水平,减少乳酸生成;ATP的降低时反而升高细胞活性氧水平。JC-1实验结果显示:细胞内线粒体膜电位水平呈下降趋势。同时也显示BAY-876增强TAM诱导乳腺癌细胞MCF-7和T-47D发生早期凋亡。5.BAY-876增强TAM诱导乳腺癌细胞MCF-7和T-47D发生自噬使用BAY-876、TAM、BAY-876&TAM分别作用于乳腺癌细胞MCF-7和T-47D48h后,与空白组相比,TAM、BAY-876作用于乳腺癌细胞MCF-7和T-47D后的自噬相关蛋白LC3-II的积累,Beclin-1表达量的升高,P62表达下降。电镜观察,与对照组相比,BAY-876、TAM处理过的乳腺癌细胞内自噬比较活跃,BAY-876&TAM组胞浆内可见线粒体嵴断裂且肿胀变形,空泡化,自噬小体数量均较对照组组明显增多。以上结果提示联合治疗增强了自噬诱导作用。6.BAY-876增强TAM诱导乳腺癌细胞MCF-7和T-47D能量调控信号通路的变化乳腺癌细胞在药物处理48h时,BAY-876、TAM单药和联合给药处理后磷酸化AKT(p-AKT)含量降低,而其下有信号分子磷酸化mTOR(p-mTOR)也随之降低;同时在肿瘤组织中磷酸化的PI3K和AKT的表达降低,提示BAY-876联合TAM可能通过下调PI3K/AKT/mTOR信号通路来激活自噬致使乳腺癌细胞发生死亡。7.BAY-876增强TAM在体内的抗肿瘤作用使用T-47D细胞建立乳腺癌模型后,分为4组:PBS组、BAY-876组、TAM组、BAY-876&TAM组。体内实验结果显示:与单独BAY-876、TAM处理组相比,BAY-876联合TAM显著抑制肿瘤的增长,具有良好的抗肿瘤效果。结论:他莫昔芬作用于乳腺癌细胞时伴随能量代谢异常,葡萄糖转运蛋白1抑制剂BAY-876增强他莫昔芬(TAM)对乳腺癌细胞的敏感性,这种增敏作用机制可能与抑制Glut1下调PI3K信号通路诱导细胞自噬和凋亡有关。同时,在裸鼠移植瘤实验中也证实,BAY-876增强TAM在体内的抗肿瘤作用。