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蛋白质翻译后修饰(Protein post-translational modification, PTM)是指mRNA翻译后蛋白质的化学修饰，主要包括磷酸化，甲基化，糖基化和泛素化等。蛋白质翻译后修饰是一个复杂的过程，经过修饰后的蛋白类型增多，结构更复杂、调控更精确、作用更专一、功能更完善。UFM1(ubiquitin-fold modifier 1)类泛素化修饰与泛素化修饰过程极其相似，但是功能迥异。已有的研究表明UFM1修饰系统在内质网应激、细胞稳态以及炎症反应等多种生命活动中起重要作用。前期的研究发现Ufl1(UFM1-protein ligase 1)蛋白在小鼠的心脏，睾丸，肝脏和脑中高表达，揭示其在能量代谢活跃的组织中可能发挥着重要作用。随着近几年UFM1修饰系统研究的增多，越来越多的研究揭示了UFM1修饰系统在各个组织器官中的重要作用，但是目前为止关于Ufl1在脑组织中的研究还不是很多。在本研究中构建了神经细胞内组织特异性敲除Ufl1基因的模型小鼠，进而研究Ufl1基因在神经系统中的潜在作用。
为了研究Ufl1基因在小鼠神经系统中的重要作用，我们利用Cre-Loxp系统组织特异性敲除目的基因。本研究在Ufl1基因的7号外显子两端插入了两个Loxp位点，构建了Ufl1flox/flox(Ufl1F/F)小鼠，再利用Ufl1F/F小鼠与神经细胞中特异性表达Cre重组酶的NestinCre工具鼠交配，获得在神经细胞中特异性敲除Ufl1基因的转基因小鼠。NestinCre转基因小鼠是神经细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠，该小鼠的Cre重组酶活性由神经细胞特异性巢蛋白Nestin基因启动子调控，只会在特异性表达巢蛋白的细胞中表达Cre重组酶。我们将Ufl1F/F转基因小鼠与NestinCre转基因小鼠杂交，获得Ufl1F/+NestinCre基因型的小鼠后代，后者再次与Ufl1F/F小鼠或者Ufl1F/+NestinCre小鼠杂交后可获得在神经细胞中敲除Ufl1基因的纯合体。
所有的小鼠在出生后均对其进行基因型鉴定，对部分小鼠进行固定包埋切片，用于HE染色和免疫荧光染色。部分Ufl1F/FNestinCre小鼠的脑组织加入组织裂解液或蛋白裂解液提取总RNA和总蛋白，用于RT-PCR分析实验和蛋白免疫印迹实验，检测Ufl1敲除效果。所有的Ufl1F/FNestinCre基因型小鼠均在出生后24小时内因呼吸衰竭死亡。组织形态学实验发现，Ufl1F/FNestinCre与正常野生型小鼠在体重方面并无差异，但是在呼吸频率上显著低于正常小鼠，并且HE染色结果也在多个脑区发现了由急性缺氧造成的红色神经元。通过进一步的分子实验，我们检测了多个与呼吸系统发育或化学敏感性呼吸相关的基因，均发现显著性的变化，说明在出生后的Ufl1F/FNestinCre小鼠的脑中的呼吸节律是紊乱的。Phox2b(Paired like homeobox 2B)在之前的研究中被证明是一类与小鼠出生后呼吸和存活的关键因素。蛋白质免疫印迹实验发现Phox2b在Ufl1F/FNestinCre小鼠的脑干组织中低表达，并且免疫荧光双染实验发现在旁呼吸组(the parafacial respiratory group，pFRG)区域的Phox2b蛋白表达异常，这个区域的Phox2b阳性神经元被证明是呼吸节律发生中重要参与者。综上所述，Ufl1敲除小鼠呼吸中枢的功能缺失和紊乱导致了小鼠出生后由于呼吸衰竭死亡。
为了验证在神经细胞中缺失了Ufl1基因是否对小鼠神经元数量有无影响，我们通过Nissl染色，在组织形态学方面观测了Ufl1F/FNestinCre小鼠神经元的数量，发现在大脑皮层，海马，小脑和脊髓多个位置的染色变浅，神经元数量减少，特别是在脊髓的白质和小脑的浦肯野细胞层尤其明显。由此推测Ufl1基因的缺失导致了神经系统发育不良。mTOR(mechanistic target of rapamycin kinase)信号通路作为哺乳动物体内调控细胞生长发育的关键性调控因子，为了评估Ufl1缺失是否影响到mTOR信号通路，利用RT-PCR实验检测了Akt-mTOR信号通路的mRNA水平变化，发现关键性的mTORC1复合体mRNA水平均受到抑制，进一步的Westernblot实验发现了mTOR的磷酸化水平和Raptor(Regulatory associated protein of MTOR complex 1)蛋白水平发生了显著性的降低，表明在Ufl1F/FNestinCre小鼠的神经细胞生长发育受到了抑制，这种mTOR信号不足导致神经系统发育异常也可能是小鼠出生后死亡的关键因素。
在之前的研究中，我们一方面发现了原本核内表达的转录因子Phox2b在细胞核周围大量聚集，致使小鼠因呼吸衰竭死亡。另一方面，在Ufl1F/FNestinCre小鼠神经细胞中mTOR信号水平被抑制，使得在小鼠的神经元数量减少和蛋白质合成受到抑制。为深入的探究Ufl1、mTOR和Phox2b三者之间的关系，我们选取了SH-SY5Y细胞系先后干扰了Ufbp1(DDRGK domain-containing protein 1)和Raptor。在敲低Ufbp1后，细胞的增殖能力受到明显的抑制这与缺失mTOR信号反应是一致的。另外，在敲低Ufbp1后的SH-SY5Y细胞中，通过免疫荧光染色发现了在体内相似的Phox2b蛋白表达异常。此外，敲低Raptor后，Wersternblot实验也获得了Phox2b显著下调的结果。通过Co-IP实验，我们证实了Ufl1与Ufbp1蛋白的相互作用和mLST8(MTOR associated protein, LST8 homolog)和Phox2b存在的直接相互作用。
总而言之，在正常的小鼠神经系统发育过程中Ufl1基因是不可缺少的，Ufl1不仅可以与mTOR信号通路相互作用直接影响mTOR蛋白的活性，而且Ufl1还可以通过mTOR调节转录因子Phox2b的表达，致使Ufl1F/FNestinCre小鼠在出生后死于呼吸衰竭。
为了研究Ufl1基因在小鼠神经系统中的重要作用，我们利用Cre-Loxp系统组织特异性敲除目的基因。本研究在Ufl1基因的7号外显子两端插入了两个Loxp位点，构建了Ufl1flox/flox(Ufl1F/F)小鼠，再利用Ufl1F/F小鼠与神经细胞中特异性表达Cre重组酶的NestinCre工具鼠交配，获得在神经细胞中特异性敲除Ufl1基因的转基因小鼠。NestinCre转基因小鼠是神经细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠，该小鼠的Cre重组酶活性由神经细胞特异性巢蛋白Nestin基因启动子调控，只会在特异性表达巢蛋白的细胞中表达Cre重组酶。我们将Ufl1F/F转基因小鼠与NestinCre转基因小鼠杂交，获得Ufl1F/+NestinCre基因型的小鼠后代，后者再次与Ufl1F/F小鼠或者Ufl1F/+NestinCre小鼠杂交后可获得在神经细胞中敲除Ufl1基因的纯合体。
所有的小鼠在出生后均对其进行基因型鉴定，对部分小鼠进行固定包埋切片，用于HE染色和免疫荧光染色。部分Ufl1F/FNestinCre小鼠的脑组织加入组织裂解液或蛋白裂解液提取总RNA和总蛋白，用于RT-PCR分析实验和蛋白免疫印迹实验，检测Ufl1敲除效果。所有的Ufl1F/FNestinCre基因型小鼠均在出生后24小时内因呼吸衰竭死亡。组织形态学实验发现，Ufl1F/FNestinCre与正常野生型小鼠在体重方面并无差异，但是在呼吸频率上显著低于正常小鼠，并且HE染色结果也在多个脑区发现了由急性缺氧造成的红色神经元。通过进一步的分子实验，我们检测了多个与呼吸系统发育或化学敏感性呼吸相关的基因，均发现显著性的变化，说明在出生后的Ufl1F/FNestinCre小鼠的脑中的呼吸节律是紊乱的。Phox2b(Paired like homeobox 2B)在之前的研究中被证明是一类与小鼠出生后呼吸和存活的关键因素。蛋白质免疫印迹实验发现Phox2b在Ufl1F/FNestinCre小鼠的脑干组织中低表达，并且免疫荧光双染实验发现在旁呼吸组(the parafacial respiratory group，pFRG)区域的Phox2b蛋白表达异常，这个区域的Phox2b阳性神经元被证明是呼吸节律发生中重要参与者。综上所述，Ufl1敲除小鼠呼吸中枢的功能缺失和紊乱导致了小鼠出生后由于呼吸衰竭死亡。
为了验证在神经细胞中缺失了Ufl1基因是否对小鼠神经元数量有无影响，我们通过Nissl染色，在组织形态学方面观测了Ufl1F/FNestinCre小鼠神经元的数量，发现在大脑皮层，海马，小脑和脊髓多个位置的染色变浅，神经元数量减少，特别是在脊髓的白质和小脑的浦肯野细胞层尤其明显。由此推测Ufl1基因的缺失导致了神经系统发育不良。mTOR(mechanistic target of rapamycin kinase)信号通路作为哺乳动物体内调控细胞生长发育的关键性调控因子，为了评估Ufl1缺失是否影响到mTOR信号通路，利用RT-PCR实验检测了Akt-mTOR信号通路的mRNA水平变化，发现关键性的mTORC1复合体mRNA水平均受到抑制，进一步的Westernblot实验发现了mTOR的磷酸化水平和Raptor(Regulatory associated protein of MTOR complex 1)蛋白水平发生了显著性的降低，表明在Ufl1F/FNestinCre小鼠的神经细胞生长发育受到了抑制，这种mTOR信号不足导致神经系统发育异常也可能是小鼠出生后死亡的关键因素。
在之前的研究中，我们一方面发现了原本核内表达的转录因子Phox2b在细胞核周围大量聚集，致使小鼠因呼吸衰竭死亡。另一方面，在Ufl1F/FNestinCre小鼠神经细胞中mTOR信号水平被抑制，使得在小鼠的神经元数量减少和蛋白质合成受到抑制。为深入的探究Ufl1、mTOR和Phox2b三者之间的关系，我们选取了SH-SY5Y细胞系先后干扰了Ufbp1(DDRGK domain-containing protein 1)和Raptor。在敲低Ufbp1后，细胞的增殖能力受到明显的抑制这与缺失mTOR信号反应是一致的。另外，在敲低Ufbp1后的SH-SY5Y细胞中，通过免疫荧光染色发现了在体内相似的Phox2b蛋白表达异常。此外，敲低Raptor后，Wersternblot实验也获得了Phox2b显著下调的结果。通过Co-IP实验，我们证实了Ufl1与Ufbp1蛋白的相互作用和mLST8(MTOR associated protein, LST8 homolog)和Phox2b存在的直接相互作用。
总而言之，在正常的小鼠神经系统发育过程中Ufl1基因是不可缺少的，Ufl1不仅可以与mTOR信号通路相互作用直接影响mTOR蛋白的活性，而且Ufl1还可以通过mTOR调节转录因子Phox2b的表达，致使Ufl1F/FNestinCre小鼠在出生后死于呼吸衰竭。