胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一。我国胃癌发病率和死亡率仍高居世界第二位。胃癌的发生发展涉及微环境和基因改变,癌基因的活化是其重要机制。寻找新的癌基因并验证其对胃癌的作用,对确定生物学靶标、干预癌变具有重要意义。课题组前期通过胃癌组织基因芯片筛选可能与胃癌相关的候选基因,HoxC6是其中的一个候选促癌基因。HoxC6属同源盒基因家族(简称：Hox家族)成员,含有两个启动子,转录两条mRNA (HoxC6-1和HoxC6-2),其表达产物是重要的转录因子,在胚胎发育过程中对细胞分化和形态发育控制起重要作用,近年来研究发现,Hox家族基因与多种恶性肿瘤的发生发展及预后密切相关。HoxC6与胃癌发生发展的关系值得深入研究。本研究将通过检测胃癌组织及胃癌细胞株中HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2的表达水平,分析三者与患者临床病理资料之间的相关性；通过siRNA干扰技术,特异性降低HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2表达,观察其对胃癌细胞恶性生物学行为(细胞增殖、迁移、侵袭等)的影响,同时运用生物信息学技术筛选HoxC6潜在调控的基因、核酸并进行初步验证。研究内容1、HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2在胃癌中的表达,及其与胃癌临床资料之间的相关性①实时定量PCR(qRT-PCR)检测比对47对胃癌组织与配对正常胃组织中HoxC6、 HoxC6-1及HoxC6-2 mRNA表达水平；②结合胃癌患者临床、病理资料,分析HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2 mRNA表达水平与各临床、病理资料之间的相关性；③ qRT-PCR和Western Blot检测7株胃癌细胞及1株正常胃粘膜上皮细胞中HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2的表达情况。2、特异性siRNA干扰HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2后胃癌细胞恶性生物学行为的变化①采用细胞活性实验(MTS)观察siRNA干扰HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2对SGC-7901和BGC-823细胞增殖的影响；② Transwell迁移和侵袭实验研究siRNA干扰HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2对SGC-7901和BGC-823细胞迁移、侵袭的影响；③采用流式细胞仪检测siRNA干扰HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2后SGC-7901和BGC-823细胞的凋亡和细胞周期变化。3. HoxC6潜在调控基因、核酸的筛选及初步验证运用生物信息学技术(TFSEARCH、TRANSFEC、MEME等软件)预测HoxC6可能调控的基因或核酸,联合genecards、pubmed、文献等综合得出基因、核酸的功能,结合前期实验中HoxC6在增殖、迁移、侵袭等方面的作用,筛选出HoxC6可能调控的有功能的基因、核酸,并分别在转染HoxC6 siRNA的SGC-7901和BGC-823细胞中进行qRT-PCR验证。研究结果：1、HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2在胃癌组织中表达量明显增加,表达水平与胃癌患者肿瘤分期及淋巴结浸润等呈不同程度相关①胃癌组织中HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2 mRNA水平较正常胃组织显著上调(p<0.01)；②HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2 mRNA水平与胃癌患者肿瘤分期及淋巴结浸润等呈不同程度相关；③HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2在SGC-7901、BGC-823胃癌细胞株中表达量均相对较高(用升高倍数folds±方差SD表示)。HoxC6:2.76±0.02、4.21±0.06; HoxC6-1:2.39±0.35、1.81±0.07; HoxC6-2:2.65±0.29、5.41±0.21。2、siRNA干扰HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2能不同程度抑制胃癌细胞增殖,siRNA干扰HoxC6-2能显著抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。①建立了分别成功干扰HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2的胃癌细胞株系SGC-7901和BGC-823,通过qRT-PCR和Western Blot检测进行了验证；② siRNA分别干扰HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2能显著抑制胃癌细胞的增殖(p<0.01)(SGC-7901:抑制率IR依次为12.7%、9.76%、29.54%; BGC-823: IR依次为41.16%、38.08%、44.86%)；③与空载组相比,干扰HoxC6-2能显著抑制胃癌细胞的迁移(SGC-7901：抑制率IR= 65.62%、p<0.01; BGC-823:IR=56.75%、p=0.04)和侵袭(SGC-7901: IR=55.72%、p=0.03; BGC-823:IR=46.07%、p<0.01);总凋亡较空载组显著增加(SGC-7901:5%±0.18%/7.94%±0.52%, p<0.01; BGC-823: 5.2%±0.47%/10.25%±0.58%, p<0.01)、显著影响细胞周期(SGC-7901:G2期增加,p=0.02; BGC-823:G1期增加,p<0.01)；而干扰HoxC6、HoxC6-1时,胃癌细胞的上述生物学行为受到影响,但没有统计学差异(p>0.05)。3. HoxC6潜在调控基因、核酸的筛选及初步验证①运用生物信息学技术预测到HoxC6可能调控的基因53个、micRNA和lncRNA共22个；②筛选出重要的基因7个(JunD、BMP7、Bcl-2、MKI67、WIF1、CASP1、Spl); qRT-PCR证实siRNA干扰HoxC6后,JunD、BMP7、MKI67、CASP1、Spl mRNA水平显著升高,而WIF1、Bcl-2mRNA水平明显下降。③同时筛选到一个重要的长链非编码RNA HOTAIR,发现HOTAIR在胃癌组织及多种胃癌细胞株中表达升高。siRNA干扰HoxC6后,HOTAIR的表达水平显著降低。研究结论1. HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2在人胃癌组织中表达量增加；2、HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2的表达与胃癌患者肿瘤分期及淋巴结浸润等呈不同程度相关；3、干扰HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2可明显抑制胃癌细胞的增殖,尤以干扰HoxC6-2时抑制作用最明显,且对胃癌细胞迁移和侵袭有明显抑制作用。研究结果提示HoxC6在胃癌的发生中可能扮演促癌基因的角色；4、HoxC6可能通过与长链非编码RNA HOTAIR互作,从而促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。