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[研究目的]SnoN基因是上世纪八十年代发现的一种原癌基因,是属于Ski家族的核内癌蛋白。国内外许多研究发现SnoN具有多种生物活性,它对在胚胎发育、成人组织的分化调节及肿瘤的发生发展都有重要意义。近年来对SnoN基因在肿瘤中的作用的研究成为热点,研究主要集中在食管癌、胰腺癌、白血病、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤中,在肝癌中的作用尚不明确。本研究采用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)技术下调HepG2细胞中SnoN基因的表达,检测人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡等生物学特性方面的变化,探讨SnoN基因在肝癌发生发展中的作用及意义,为肝癌发病机制的研究和肿瘤的基因治疗提供理论依据和治疗靶点。[研究方法](1)复苏、培养人肝癌细胞至对数生长期备用。HepG2(2)参照在中公布的GeneBank基因序列(NM005414),依据SnoN的siRNA设计原则,由上海吉玛公司设计并化学合成3条靶向基因的干扰序列、1条非SnoN特异性的阴性对照序列和1条羧基荧光素(FAM)标记的非特异性序列。(3)常规培养细胞,阳离子脂质体HepG2瞬时转染法将不LipofectamineTM2000同浓度的分别转染至FAM-siRNA细胞内,通过流式细胞术测定各组细胞中HepG2FAM荧光的表达情况来检测转染效率,选择最佳转染浓度。(4)采用逆转录-聚合酶链反应检测(RT-PCR)干扰后siRNA基因在SnoN水平的表达情况,nRNA的方法检测Western Blot基因在蛋白水平的表达情况,比较SnoN三条的抑制效率,筛选出一条抑制效率最佳的干扰序列。siRNA(5)采用CCK-8细胞活性检测方法分别检测空白组、阴性对照组和干扰组的细胞增殖情况。HepG2(6)采用流式细胞仪(Annexin V/PI双染法)分别检测空白组、阴性对照组和干扰组HepG2细胞的凋亡情况。[结果](1) siRNA转染效率检测结果显示,最优转染效率可达84.8%, siRNA最佳转染浓度为100nmol/L,以相同实验条件进行后续转染实验。(2) RT-PCR和Western Blot结果显示,siRNA转入HepG2细胞后,三个干扰组的SnoN mRNA和SnoN蛋白的表达水平与空白组和阴性对照组相比均有下降,以siRNA-C干扰效果最好,抑制效率可达62.4%。空白组和阴性对照组相比,无明显差异。(3)CCK-8结果显示,siRNA转染后,干扰组与空白组和阴性对照组相比,细胞增殖速率明显减慢,以转染后第3天,增殖活力降低最明显(0.687vs1.548,1.378,P<0.05)。(4)流式细胞术结果显示,转染48小时后,干扰组与空白对照组和阴性对照组相比,细胞早期凋亡增加(9.84%vs0.65%,1.78%,P<0.05)。[结论]阳离子脂质体瞬时转染法可有效转染siRNA, siRNA浓度为100nmol/L时,转染效率可达84.8%。靶向SnoN基因的三条siRNA均有一定的干扰效果,能够在mRNA和蛋白水平有效抑制SnoN的表达。SnoN基因表达下调后,人肝癌HepG2细胞增殖减慢,细胞凋亡增加。提示SnoN基因在肝癌的发生发展中发挥一定的促进作用,有可能成为肝癌治疗的新靶点。