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宫颈癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一。据全球癌症统计数据显示,2018年全球女性中有860万新增癌症患者,其中47.5%的新发病例来自亚洲,宫颈癌的发生率及死亡率位居第四位,严重威胁着全球女性的身心健康。高危型人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的持续感染是正常宫颈发展成宫颈癌的一个关键因素。随着HPV的筛查和疫苗的产生,宫颈癌的发病率有所下降。然而对缺乏疫苗接种计划和规范性的HPV筛查的一些低中收入国家,仍需寻找一些新的诊疗方法。卵泡抑素样蛋白1(Follistatin-like protein 1,FSTL1)是一种分泌型糖蛋白。研究表明,FSTL1在多种肿瘤组织中存在异常表达,FSTL1的异常表达与癌症患者的临床病理参数密切相关。FSTL1可通过减弱或增强肿瘤细胞的增殖、迁移及转移能力参与肿瘤相关疾病的发生和发展。然而FSTL1在宫颈癌中的作用及其机制目前尚未见报道。本研究旨在检测FSTL1m RNA和蛋白在宫颈癌中的表达情况,分析FSTL1与宫颈癌患者的临床病理参数和高危型HPV感染的关系。探讨过表达和敲除FSTL1对宫颈癌细胞体内及体外生物学功能的影响及FSTL1在宫颈癌中可能存在的调控机制。方法1.收集2012-09至2017-06来自广西壮族自治区人民医院妇科宫颈癌组织样本127例和正常宫颈组织样本22例。运用实时荧光定量PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR)和免疫组化技术分别检测77例和84例宫颈癌组织中FSTL1m RNA和蛋白的表达情况,分析FSTL1与宫颈癌患者的临床病理参数的关系。2.提取66例宫颈癌组织DNA,利用巢式PCR(nested multiplex polymerase chain reaction,NMPCR)技术检测宫颈癌患者组织中高危型HPV-16、18、45、52、58、31的感染状况,分析FSTL1与高危型HPV感染的关系。3.运用慢病毒载体技术,构建带有嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的过表达FSTL1慢病毒载体。嘌呤霉素筛选出稳定过表达FSTL1的宫颈癌He La和Si Ha细胞稳定株,检测过表达FSTL1对宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等体外生物学功能影响。构建带有嘌呤霉素抗性基因的CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)相关蛋白9(CRISPR associated protein 9,Cas9)和带有GFP的小向导RNA(small guide RNA,sg RNA)慢病毒质粒。运用CRISPR/Cas9基因敲除技术敲除FSTL1基因。筛选出稳定敲除FSTL1的宫颈癌He La和Si Ha细胞稳定株,检测敲除FSTL1对宫颈癌细胞株增殖、迁移、侵袭和凋亡等体外生物学功能影响。4.选取4-6周的BALB/C裸鼠,实验组在裸鼠皮下分别注射过表达或敲除FSTL1的宫颈癌He La和Si Ha细胞稳定株,阴性对照组分别在裸鼠皮下注射含有空载体的宫颈癌He La和Si Ha细胞稳定株。每组6只。建立宫颈癌移植瘤模型,待皮下移植瘤成瘤后,每隔3天测量各组裸鼠体内移植瘤的大小。27天后处死全部裸鼠,测量移植瘤重量并检测各组移植瘤中FSTL1的表达量。5.对过表达FSTL1的宫颈癌He La细胞稳定株进行基因组芯片检测。分析FSTL1下游基因表达的变化并对差异表达基因进行功能注释描述和分类、信号通路富集分析,筛选出过表达FSTL1的宫颈癌He La细胞稳定株中变化最明显的信号通路。利用western blotting检测该条信号通路及下游分子表达量的变化。结果1.FSTL1m RNA在77例宫颈癌组织样本中的相对表达量比29例宫颈癌旁组织样本及21例正常宫颈组织样本低(P<0.001)。FSTL1m RNA的低表达与肿瘤的低分化(P<0.001)、大肿瘤(P=0.003)、深度浸润(P=0.042)、晚FIGO分期(P=0.001)有关。FSTL1蛋白在84例宫颈癌组织样本中的表达量比22例正常宫颈组织样本中的表达量低(P=0.006)。FSTL1蛋白的低表达与肿瘤的深度浸润(P=0.004)和低分化(P=0.001)有关。2.FSTL1m RNA在高危型HPV感染阳性组中的相对表达量比高危型HPV感染阴性组中的相对表达量低(P<0.002);FSTL1m RNA高表达组的HPV感染率低于低表达组(P=0.021);He La细胞分别转染HPV18E6和E7 si RNA后,FSTL1m RNA的相对表达量较各自的阴性对照组(Negative control,NC)及空白对照组(MOCK)上调,差异有统计学意义(P<0.001)。3.筛选出过表达FSTL1的宫颈癌He La和Si Ha细胞稳定株。MTT和克隆形成实验表明,He La和Si Ha细胞过表达组(OE,Over-expression)中的细胞增殖能力低于NC组和MOCK组,差异具有统计学意义(P≤0.007)。He La细胞OE组在第3天细胞的增殖能力低于NC组和MOCK组(P=0.001)。Siha细胞OE组在第4天细胞的增殖能力低于NC组和MOCK组(P=0.007)。划痕实验和Transwell迁移实验表明,He La和Si Ha细胞OE组中的细胞划痕愈合率低于NC组和MOCK组(P≤0.002)。He La和Si Ha细胞OE组穿出基底膜的细胞数小于NC组和MOCK组(P≤0.002)。Transwell侵袭实验表明,He La和Si Ha细胞OE组穿出基质胶膜的细胞数小于NC组和MOCK组(P≤0.001)。Annexin V-APC/PI细胞凋亡实验表明,He La和Si Ha细胞OE组中的细胞凋亡率高于NC组和MOCK组(P≤0.003)。相反,筛选出敲除FSTL1的宫颈癌He La和Si Ha细胞稳定株。MTT和克隆形成实验表明,He La和Si Ha细胞敲除组(Knockout,KO)中的细胞增殖能力高于NC组和MOCK组,差异具有统计学意义(P<0.001)。He La细胞KO组在第2天细胞的增殖能力高于NC组和MOCK组(P<0.001)。Siha细胞KO组在第2天细胞的增殖能力高于NC组和MOCK组(P=0.045)。划痕实验和Transwell迁移实验表明,He La和Si Ha细胞KO组中的细胞的划痕愈合率高于NC组和MOCK组(P<0.001)。He La和Si Ha细胞KO组穿出基底膜的细胞数大于NC组和MOCK组(P<0.001)。Transwell侵袭实验表明,He La和Si Ha细胞KO组穿出基质胶膜的细胞数大于NC组和MOCK组(P<0.001)。Annexin V-APC/PI细胞凋亡实验表明,He La和Si Ha细胞KO组中的细胞凋亡率低于NC组和MOCK组(P≤0.038)。4.与宫颈癌He La和Si Ha细胞NC组皮下移植瘤相比,OE组中的裸鼠皮下移植瘤的终体积及重量均小于NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。OE组中的FSTL1m RNA和蛋白的表达量均高于NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。而KO组中的裸鼠皮下移植瘤的终体积及重量均大于NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。KO组中的FSTL1m RNA和蛋白的表达量均低于NC组(P<0.05)。5.与NC相比,OE组中有881个差异表达基因,FSTL1的差异表达基因主要富集在转录调控、细胞增殖、凋亡、胚胎发育以及缺氧应激等生物过程上。KEGG和IPA信号通路富集分析显示,FSTL1的差异表达基因主要富集在癌症转录误调节信号通路、丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路、癌症信号通路、P53信号通路和IGF-1信号通路等,其中IGF-1信号通路被显著激活。Western blotting实验结果表明,在宫颈癌He La和Si Ha细胞株中过表达FSTL1后,OE组中的IGF-1R、PI3K、P-AKT、BCL-2蛋白的相对表达量均低于相应的NC组,而BAX蛋白的相对表达量高于相应的NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。相反,在宫颈癌He La和Si Ha细胞株中敲除FSTL1后,KO组中IGF-1R、PI3K、P-AKT、BCL-2蛋白的相对表达量均高于相应的NC组,而BAX蛋白的相对表达量低于相应的NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.FSTL1m RNA和蛋白在宫颈癌组织中表达下调,FSTL1的低表达与宫颈癌患者的深度浸润、低分化、大肿瘤、晚FIGO分期有关。2.FSTL1m RNA在高危型HPV感染阳性组中的表达量低于高危型HPV感染阴性组;FSTL1m RNA高表达组的高危型HPV感染率低于低表达组FSTL1m RNA的高危型HPV感染率;HPV18E6和E7癌蛋白基因可以抑制FSTL1m RNA的表达。3.FSTL1可以抑制宫颈癌细胞He La和Si Ha的增殖、侵袭、迁移能力和促进凋亡。4.FSTL1可以抑制宫颈癌皮下移植瘤的生长。5.FSTL1的差异基因富集于转录调控、细胞增殖、凋亡、黏附等生物学过程,FSTL1可能通过下调IGF-1R/PI3K/AKT/BCL-2/BAX信号通路,抑制宫颈癌细胞增殖和促进宫颈癌细胞凋亡。