不孕症是指一年未采取任何避孕措施,性生活正常而没有成功妊娠,其中单纯男性因素占40%左右,双方因素约为20%。近年来据不完全统计,因男性因素而寻求辅助生殖技术治疗的比例在逐渐上升,其中约有10%-15%的男性是因为遗传学因素导致的不育,但没有相应的临床治疗方法去改善因遗传学因素导致的男性不育状况。这就迫切的需求我们去认知精子发生过程的分子生物学机制。精子发生(Spermatogenesis)是指睾丸生殖干细胞在经过减数分裂和有丝分裂分化为精原细胞,并通过形态学的改变最终分化为成熟精子细胞的一系列复杂的生物学过程。大约有3000个基因涉及到生精干细胞的分化和发展过程,但是对于精子发生的分子机制,尚未完全阐明,所以对于鉴定和了解在精子发生过程中的新的关键基因,阐明精子发生的分子机制,对于人类生殖健康、男性不育的防治、与避孕疫苗的研发是十分重要的。通过乙酰基亚硝基脲(Ethylnitrosourea,ENU)随机突变方法,我们发现和鉴定了一个新的小鼠精子发生相关基因:lrguk(Leucine-Rich repeats and Guanylate Kinase domain containing)。lrguk在小鼠中有3个转录子,其中转录子1(lrguk-1)长度为3058bp,编码长度为820个氨基酸,长度为93k Da的蛋白,小鼠的lrguk-1共含有20个外显子,在lrguk-1的14号外显子一个CàT的点突变导致在LRGUK的第528位的氨基酸(精氨酸)突变为终止子,导致蛋白编码的提前终止,产生一个截断蛋白,并导致雄性小鼠的不育。lrguk-1突变小鼠,主要表现为纯合型突变雄性小鼠的完全不育,具体表现为精子数目的减少,精子形态的畸形及精子活力的丧失,即重度少弱精症(OAT),睾丸组织切片HE染色显示睾丸精子发生过程紊乱,所以在此次研究中我们用Kaos来命名这个突变小鼠系(Chaotic spermatogenesis),lrguk-1杂合型突变雄性小鼠及lrguk-1纯合型突变雌性小鼠的生育力并不受任何影响。目前还没有关于lrguk基因功能研究的任何报道,因此我们对lrguk基因与雄性小鼠生殖力及其在精子发生过程的功能进行了初步研究。第一部分lrguk与雄性小鼠生殖力的关系研究目的:通过研究lrguk-1Kaos/Kaos小鼠(纯合型lrguk突变雄性小鼠)和lrguk-1WT/WT小鼠(野生型雄性小鼠)的睾丸组织精子发生的对比,探讨lrguk-1与雄性小鼠生殖力之间的关系,及其lrguk-1在男性精子发生过程的功能。研究方法:比较分析成年(>8周)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠PAS染色睾丸组织切片分析睾丸结构差异、比较分析成年(>8周)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠HE染色附睾组织切片比较分析精子数目;比较分析成年(>8周)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠HE染色成熟精子形态学对比;比较分析成年(>8周,n=5)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睾丸日精子产量差异(Daily sperm producitn,DSP);比较分析成年(>8周,n=5)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠附睾精子数目对比(Daily sperm producitn,DSP);比较分析分别day0、day7、day14、day18、day20、day30、day60出生小鼠的睾丸组织lrguk-1表达;比较分析lrguk-1在睾丸、肝脏、肺脏、脑、支气管、卵巢等多种组织中的表达;通过stereology方法比较分析lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠各阶段精子细胞数目的差异(Sg:Spermatogonia精原细胞;e Sc,early Spermatocyte,早期精母细胞;l Sc,late Spermatocyte晚期精母细胞;r ST,round spermatid圆形精子细胞;el ST,elongating spermatids变形期精子细胞;ret,retained Spermatids滞留精子细胞),比较分析成年(>8周)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睾丸组织凋亡情况分析;比较分析成年(>8周)lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睾丸组织γ-H2AX表达对比。结果:1.纯合lrguk-1突变可以导致雄性小鼠的不育;2.lrguk-1主要是在睾丸组织内高表达,且在一些含纤毛组织(肺、脑、肾脏等)微量表达;3.lrguk-1的表达在减数分裂开始时进行表达,在第一波生精波完成时达到高峰;4.lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠相比,睾丸体重有13%的减少,有显著性差异(P<0.05),日精子产量有81%的减少,有显著性差异(P<0.001);附睾精子总数目有79%的差异,有统计学差异(P<0.001);5.stereology比较分析lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睾丸各级别精子数目:精原细胞有23.46%减少,,有统计学差异(P<0.01),变形期精子细胞有33.11%减少,有统计学差异(P<0.01),在lrguk-1Kaos/Kaos小鼠stage IX期曲细精管内发现大量滞留精子细胞。6.PAS染色成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睾丸组织切片结果显示:lrguk-1Kaos/Kaos小鼠睾丸各级生精细胞结构大致正常,圆形精子细胞周围开始出现顶体碎片,精子细胞数目减少、精子头部形态学畸形及精子尾部形态学畸形或缺失;7.HE染色lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠附睾组织切片结果显示:lrguk-1Kaos/Kaos小鼠附睾内精子数目减少,精子形态学畸形及精原细胞脱落;8.HE染色精子结果显示:lrguk-1Kaos/Kaos小鼠成熟精子有精子头部畸形及精子尾部形态学畸形或缺失;精子活力丧失。9.成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠的睾丸组织凋亡率无显著性差异,但是γ-H2AX在lrguk-1Kaos/Kaos小鼠变形期精子细胞内高表达。结论:1.lrguk在小鼠中有3个转录子,目前证实lrguk-1与男性生殖力有着密切的关系。2.lrguk-1是一个睾丸特异基因,在减数分裂开始时进行表达,并在第一波生精波完成时几乎达到高峰。3.lrguk-1主要由含纤毛组织表达:如睾丸、支气管、脑、肾脏等。4.lrguk-1第14号外显子的基因突变导致睾丸精子发生障碍,主要变现为精子数目的减少、精子形态学异常及精子活力丧失即重度少弱畸精子症:(oligo-atheno-terato-spermia,OAT)。第二部分LRGUK-1与精子头部塑形的功能研究研究目的:通过对成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睾丸组织和不同阶段精子细胞中的LRGUK的表达及其定位,成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠不同阶段精子及其超微结构的差异,及与候选蛋白RIM-BP3的功能验证,来阐述LRGUK在精子头部塑形过程的功能及其分子机制探讨。研究方法:利用STAPUT方法,获得成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠不同阶段的精子细胞和睾丸组织切片,利用特异性LRGUK抗体,与顶体标记物PNA、manchette标记物α-tubulin、鞭毛标记物acetylated tubulin进行免疫荧光共定位研究;电子显微镜分析比较成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睾丸组织和精子细胞的顶体发、manchette、perinuclear ring、基部小体、中心粒附属器等结构超微结构;利用免疫荧光共定位、GFP-pull down和免疫共沉淀实验验证LRGUK与RIM-BP3的结合。结果:1.免疫荧光染色结果显示LRGUK首先定位于圆形精子细胞的顶体,随着精子细胞的分化,LRGUK逐渐迁移至Acroplaxome部位,接着在精子头部塑形过程中,LRGUK定位于manchette微管结构中,随着精子尾部的形成,LRGUK定位于精子的基部小体,并且最终定位于精子鞭毛轴丝上。2.lrguk-1Kaos/Kaos小鼠最先出现的异常为顶体碎片的出现,电子显微镜超微结构发现10%延长期精子细胞顶体与精子细胞核分离,且高尔基体分泌的顶体前囊泡表面不平滑。3.lrguk-1Kaos/Kaos小鼠manchette结构起始及消失的时间正常,向精子尾部的迁移大致正常,但是manchette结构形态学异常,表现为微管分布不平行,出现撕裂状态;结构异常分散、少数结构与细胞核分离;电子显微镜超微结构证实了manchette结构异常,同时发现异常缩窄的perinuclear ring结构。4.大量的截断LRGUK-1蛋白堆积在lrguk-1Kaos/Kaos小鼠acroplaxome结构处;lrguk-1Kaos/Kaos小鼠精子头部形态学的畸形改变。5.免疫荧光染色分析LRGUK与manchette结构相关蛋白RIM-BP3共定位于manchette结构,并用细胞转染及GFP-pull down和免疫共沉淀验证LRGUK与RIM-BP3的结合。结论:1.LRGUK-1可能通过参与高尔基体分泌的顶体前囊泡的运输和融合参与精子顶体形和acroplaxome结构形成;LRGUK-1参与manchette结构形成。2.LRGUK-1 C末端的293个氨基酸在蛋白质从acroplaxome到manchette的转运过程中起到关键作用。3.LRGUK-1通过Acrosome-Acroplaxome-Manchette复合体参与精子头部的塑形。4.LRGUK-1是一种支架蛋白,与RIM-BP3共同作用于acrosomeacroplaxome-manchette复合体参与精子头部的塑形和蛋白质的运输。第三部分LRGUK-1在小鼠精子尾部发生和延伸的功能研究研究目的:通过比较成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠精子活力,睾丸组织内精子尾部结构和数目,精子尾部轴丝的起始和延伸和基部小体及中心粒附属器超微结构的对比,及与候选蛋白HOOK2的功能验证,并利用ARPE-19细胞系作为纤毛模型,拟阐述LRGUK在小鼠精子尾部轴丝发生及延伸过程中的作用机制。研究方法:光学显微镜下观察和对比成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠精子活力,免疫组织化学分析lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睾丸组织中精子尾部结构和数目的差异;电子显微镜比较lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠尾部起始和延伸,及基部小体和中心粒附属器超微结构的差异;利用基因沉默技术来降低ARPE-19细胞系中lrguk-1的表达,来研究LRGUK-1在纤毛发生过程的作用,利用免疫荧光共定位、GFP-pull down和免疫共沉淀实验验证LRGUK与HOOK2的结合。结果:1.光学显微镜观察lrguk-1Kaos/Kaos小鼠精子无活力。2.成年lrguk-1Kaos/Kaos小鼠和lrguk-1WT/WT小鼠睾丸组织切片结果显示:lrguk-1Kaos/Kaos小鼠尾部缺失或形态学异常。3.电子显微镜结果显示lrguk-1Kaos/Kaos小鼠精子尾部起始障碍及尾部延伸阻滞。4.lrguk-1Kaos/Kaos小鼠精子尾部基部小体的“9×2+2”结构丧失,中心粒附属器超微结构显示大多数远端中心粒附属器结构大致正常,但大多数不与细胞膜粘附;近端中心粒附属器的结构形态异常。5.利用sh RNA进行lrguk-1在ARPE-19细胞系进行基因沉默技术,lrguk-1表达下调对ARPE-19细胞系生长速度、初级纤毛的数目及长度及中心粒结构并不受影响。6.LRGUK与HOOK2共定位与manchette结构与精子尾部基部小体,并用细胞转染及GFP-pull down和免疫共沉淀验证LRGUK与HOOK2的结合。结论:1.Lrguk-1在小鼠精子尾部形成与延伸过程起到关键作用。2.Lrguk-1可能通过作用与近端中心粒附属器影响鞭毛微管结构的形成在精子鞭毛发生过程起到关键作用。3.Lrguk-1可能通过与HOOK2相互作用,通过鞭毛内蛋白质运输(intra-flagellar transport)和manchette结构蛋白质运输(Intra manchette transport)来参与精子尾部的形成。4.Lrguk-1可能对初级纤毛没有功能影响,有待进一步验证。