论文部分内容阅读
光是控制植物生长发育最重要也是最基本的环境因素之一。不仅为植物的光合作用提供能量,同时也可作为信号调控植物的生长发育。高等植物在进化过程中已形成一套由多个光受体组成的网络,用于感受环境中时刻变化的光信号。不同光受体感受光信号变化后,蛋白构象或定位发生改变,并通过与其相互作用的信号蛋白,把外界环境的光信号变化传递到体内下游信号转导途径中,从而影响着植物的生长发育,促使植物更好的适应外界环境。FHY3 (Far-red elongated hypocotyl 3)和FAR1 (Far-red impaired response 1)是远红光信号转导途径中的两个重要组分(Wang and Deng,2002),是一类从古老的Mutator like转座酶衍变而来的新型转录因子,以同源或异源二聚体的形式特异结合在下游靶基因的FBS (FHY3/FAR1 DNA Binding sites, FBS)顺式调控元件上调控基因表达(Lin et al.,2007)。已有文章报道,FHY3/FAR1参与幼苗光形态建成、开花调节以及细胞器发育等生长发育过程。本研究以拟南芥中fhy3far1双突变体细胞死亡表型为出发点,通过分子生物学与反向遗传学的方法部分解析了FHY3/FAR1调控细胞死亡的分子机理。主要结果如下所示：(1)表型观察发现fhy3far1双突变体在短日照条件下具有严重细胞死亡表型,推测FHY3/FAR1是细胞死亡过程的负向调控因子。进一步通过DAB及NBT染色,fhy3far1双突变体体内ROS大量积累；且外源施加MV处理,FHY3功能缺失突变体更加敏感,证明FHY3/FAR1提高植物对外界氧化胁迫的适应性。(2)通过在fhy3far1双突变体背景下组成型表达SA分解相关基因S3H (SA 3-hydroxylase),可明显缓解fhy3far1双突变体短日照条件下的细胞死亡表型,表明fhy3far1的细胞死亡表型依赖SA积累。(3) FHY3/FAR1是远红光信号途径中重要的转录因子,可通过调控多个下游靶基因的表达介导植物生长发育各个过程。通过FHY3蛋白的ChIP-seq及短日照条件下fhy3far1双突变体基因芯片结果分析,对比发现25个FHY3候选下游靶基因。基于mips1具有与fhy3far1双突变体相类似的细胞死亡表型,最终推测肌醇合成途径关键酶基因MIPS1可能介导FHY3调控的氧化胁迫响应。通过研究FHY3对MIPS1的DNA启动子结合及fhy3far1中MIPS1的基因表达量检测,证明FHY3直接正向调控MIPS1的基因表达。另外,fhy3farl双突变体中,肌醇含量降低,而组成型表达MIPS1, fhy3farl双突变体中肌醇含量得到部分恢复,表明光信号蛋白FHY3通过直接激活MIPS1的基因表达促进植物体内肌醇合成。(4)FHY3对维持肌醇合成途径关键基因MIPS1的转录水平至关重要。为进一步研究FHY3对肌醇合成的重要性,通过RT-PCR检测发现肌醇代谢途径中多个相关基因如MIK、MIOX2、VTC4以及INT1的表达也受到FHY3的调控,推测FHY3介导整个肌醇代谢途径。(5)肌醇途径是抗坏血酸合成途径之一,而VTC4作为一个双功能酶可同时参与肌醇与抗坏血酸合成。通过RT-PCR检测fhy3far1双突变体中抗坏血酸合成相关基因VTC1、VTC2、VTC3、VTC4以及VTC5的表达量,结果表明FHY3正向调控VTC1-5的基因表达。通过检测抗坏血酸含量,FHY3功能缺失突变体中抗坏血酸含量明显降低,而fhy3互补株系中抗坏血酸含量增加,表明FHY3通过间接调控VTC类相关基因的表达介导植物体内抗坏血酸合成。(6)肌醇代谢对维持植物正常生长发育,抵御外界氧化胁迫是必不可少的。为探究肌醇代谢对fhy3far1双突变体生长发育的作用。通过将MIPS1-OX/fhy3far1转强光处理,结果表明MIPS1过量表达缓解fhy3far1双突变体由胁迫引起的提前衰老,证明FHY3通过促进肌醇合成以此来提高植物对外界氧化胁迫的抗逆性。综上所述,我们的研究证实细胞死亡过程负向调控子FHY3/FAR1通过直接激活MIPS1/2的转录水平,促进植物体内光调控的肌醇合成,并最终提高植物对外界氧化胁迫的适应性。为进一步解析植物抗逆分子机制奠定了科研基础和理论依据。