非生物胁迫如干旱、低温一直都是对植物影响较大的自然灾害。黄瓜作为我国主要栽培蔬菜之一,具有叶片大、根系浅等特点,需水量大且对水分反应特别敏感。干旱是夏、秋季节黄瓜育苗生产中存在的主要问题,因此探明干旱胁迫对黄瓜生长的影响以及缓解胁迫的方法对黄瓜的栽培和生长具有重要意义。本实验探究了外源咖啡酸(CA)缓解黄瓜幼苗干旱胁迫的机制,研究了外源CA对干旱胁迫下黄瓜幼苗生理生化的相关指标及基因组DNA甲基化的影响,并分离了干旱胁迫下CA诱导的DNA甲基化差异片段,然后进一步对这些差异片段进行克隆及测序。本文旨在从宏观、微观、生理和分子水平上揭示外源CA缓解干旱和低温胁迫的机制,为生产中科学应用CA及黄瓜耐干旱栽培提供更多的理论和实践依据。外源过氧化氢(H2O2)缓解干旱胁迫时分离得到两个甲基化差异基因,本课题利用绝对荧光定量PCR技术分析了两个基因的表达情况,此外还利用黄瓜授粉后外源基因直接导入技术将其中的一个基因转入黄瓜,利用PCR检测获得阳性植株,进而对该基因做了初步的功能分析。为深入阐明黄瓜对逆境胁迫的响应机理打下基础。具体研究结果如下:(1)外源CA缓解干旱胁迫时对黄瓜幼苗生长量、抗氧化酶及其相关指标的影响干旱胁迫明显导致了“津春四号”黄瓜幼苗生长指标的下降,而用外源CA预处理黄瓜幼苗,其生长量显著增加。所以,干旱胁迫严重影响了黄瓜幼苗的正常生长,而外源CA处理能够缓解干旱的抑制作用。在本实验中,干旱胁迫使黄瓜幼苗叶片的丙二醛(MDA)和内源H2O2含量以及O2.-的产生速率高于对照。但用外源CA预处理后再进行干旱胁迫时增强了叶片的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、愈创木酚过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)和谷胱甘肽还原酶(GR)等抗氧化物酶的活性,提高了抗氧化物抗坏血酸(AsA)和还原型谷胱甘肽(GSH)的含量、以及脯氨酸和可溶性糖的含量,从而降低了叶片中MDA和内源H2O2的产生速率。我们推断,外源CA预处理提高了黄瓜叶片抗氧化酶的活性,减少了活性氧含量,进而减轻了干旱胁迫对叶片膜系统的伤害。这一推断利用荧光定量在基因表达水平上进一步得到验证。(2)外源CA处理对干旱胁迫下黄瓜基因组DNA甲基化的影响通过对黄瓜叶片基因组DNA进行甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析,发现干旱胁迫影响黄瓜叶片中基因组DNA的甲基化水平。外源CA预处理会使其DNA甲基化状态进一步发生改变。(3)外源H2O2诱导的干旱处理下两个甲基化差异基因HG-1和HG-2的表达及HG-2的功能分析干旱下外源H2O2诱导的甲基化差异基因HG-1表达量在根、第二片真叶及第一片真叶均呈现H2O2+PEG处理组低于PEG处理组的趋势,而在茎和子叶中该基因的表达量与在根、第二片真叶及第一片真叶中的相反。黄瓜幼苗不同组织部位中的甲基化差异基因HG-2的表达量在H2O2+PEG处理组均低于PEG处理组,表明在干旱胁迫下经H2O2诱导后该基因“下调”表达。利用PCR技术克隆HG-2基因全长的cDNA序列,将获得的全长序列与含有35s启动子的pBI121载体重组,构建反义表达载体,转化黄瓜,用PCR方法鉴定获得转反义基因阳性植株。结果显示,转反义HG-2基因的植株比野生型表现出对干旱更强的耐受性,且其内源H2O2水平明显降低,GPX、GR、GSH-Px、DHAR和MDHAR等抗氧化物酶的活性显著增强,抗氧化物As A和GSH的含量也显著升高,初步表明HG-2基因的下调表达可能涉及H2O2缓解黄瓜干旱胁迫的机制。