木糖产PHA双菌体系构建及其代谢交流与沉降特性分析

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随着能源需求、资源危机等问题日益突出,人们开始寻找新型能源资源如聚羟基脂肪酸酯(PHA)。目前PHA生物发酵成本较高:在底物方面,常采用葡萄糖等昂贵碳源;在生产方面,常采用单一菌种;在下游加工方面,常采用长时间高速离心分离菌体。本文针对上述几方面,首次构建以木糖为底物的人工双菌体系,并对双菌代谢物质进行初步解析,同时对双菌体系表现出的优良沉降特性进行了分析。
  首先,对野生型PseudomonasputidaNBRC14164单菌进行碳源利用能力与PHA积累能力检测,最适底物为乳酸而非木糖,PHA最高积累186.6mg/L,占细胞干重17.6%。构建P.putida和改造SaccharomycescerevisiaeSyBE_Sc01020078双菌体系,后者利用木糖生产乳酸作为前者碳源,在无机盐培养基中,二者接种数量比为1:1,均为108cfu/mL,接种时间为P.putida24h与S.cerevisiae42h,摇瓶培养转速为200rpm,PHA积累最高可达295.7mg/L,占混菌细胞干重19.3%,表明双菌对单菌有很大优势。
  其次,通过高效液相色谱、基因敲除、气相色谱-质谱连用等手段分析双菌间代谢物质交流关系。接种初期P.putida首先利用木糖维持自身生长,进而为S.cerevisiae提供缺陷基酸使其存活,当S.cerevisiae开始利用木糖产生足量乳酸后,P.putida转而利用乳酸。稳定期时双菌体系有着更为丰富的胞内物质,对二十余种关键差异物质分析,这些物质涉及到糖类代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢及TAC循环等,此外还有可构成辅因子的一些基础物质。
  最后,菌落计数发现S.cerevisiae只占P.putida数量的千分之一,但双菌体系沉降效率却因S.cerevisiae的存在而高达99%,通过电子显微镜观察、Zeta电位测定、基因失活等手段分析原因如下:双菌体系比单菌中P.putida菌体长度增加,而该长度变化与PHA胞内积累量增大有关;双菌体系中S.cerevisiae表面的负电荷中和了P.putida的正电荷至等电点从而易于沉降;P.putida细胞壁可能存在类似于甘露糖残基的S.cerevisiae黏附蛋白受体或结合蛋白。
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