放射治疗和化疗是临床治疗非小细胞肺癌的有效手段之一，电离辐射和化疗药物能通过多种信号通路引起非小细胞肺癌细胞的死亡。自噬，即Ⅱ型程序性细胞死亡，是细胞在应激或损伤情况下通过形成自噬小体及溶酶体降解自身的长寿命蛋白和废用的细胞器，并对氨基酸和蛋白质重新利用，以此达到维持细胞稳态目的的过程。自噬与多种人类疾病相关，如癌症、肌肉疾病、神经衰弱、心脏和肝脏疾病和胃肠道功能紊乱等。自噬可以通过形成适应性反应维持细胞存活；但当自噬过度发生时，也可以导致自噬性细胞死亡。本研究重点观察自噬在顺铂联合放疗杀伤非小细胞肺癌细胞中的作用及其机制，为临床治疗方案的优化提供理论依据。目的探讨自噬在不同放疗方案以及放疗联合化疗治疗非小细胞肺癌中发挥的作用及可能的机制。方法(1)细胞株：本次研究中使用细胞为人类非小细胞肺癌细胞株A549和H1299。(2)动物模型制备：取对数生长期Lewis肺癌细胞,1×106于C57BL/6小鼠右后肢皮下接种。(3)实验分组: H1299细胞分为对照组(0Gy)、照射组(4Gy、8Gy)；A549细胞分为对照组(0Gy)、照射组(2Gy、8Gy)。小鼠移植瘤模型分为对照组(0Gy)、常规照射组（2Gy/次,共5天,总剂量为10Gy）、超分割组（1Gy/次,2次/天,间隔4h,共5天,总剂量为l0Gy）、联合组（2G/次,共5天,总剂量为10Gy,仅第一次照射前给予小鼠腹腔注射顺铂(3mg/kg)）、单次照射组（一次给予l0Gy照射）。(4)指标检测：MDC染色法和流式细胞术、western blot检测自噬,流式细胞术检测凋亡变化情况；MTT法检测细胞存活情况；免疫组织化学方法检测相关基因MAPLC3II、PI3KIII、BECLIN1水平变化。结果1电离辐射诱导H1299及A549细胞发生自噬电离辐射在4Gy和8Gy照射时可促进H1299细胞坏死、自噬和凋亡的发生。实验中对H1299细胞进行0Gy4Gy和8Gy照射后，分别用MDC染色法和流式细胞术检测。结果发现，细胞中出现代表自噬小泡的绿色荧光点，自噬小泡的数量随电离辐射剂量的增加而明显增加（P<0.05），说明电离辐射能够诱导H1299细胞发生自噬。流式细胞术检测结果显示，H1299细胞各组坏死率分别为4.2%，7.5%，14.3%;凋亡率为3.4%，5.3%,7.7%,各组间差异显著（P<0.05），说明电离辐射与H1299细胞坏死和凋亡相关。2顺铂对自噬和细胞存活的影响采用MTT方法检测顺铂对A549细胞存活的影响，当顺铂浓度小于5μmol/L时，其对细胞的存活影响不明显。但随着顺铂浓度的升高，A549细胞存活率降低明显，在20μmol/L处达最低值，药物浓度继续增加时其作用增强不明显。故后续实验中选择顺铂药物浓度为5μmol/L，研究其辐射增敏作用。顺铂能够影响A549细胞自噬的发生。A549细胞经0Gy、2Gy×5和2Gy×5+cis处理后，用MDC染色法检测。结果发现，与假照射组相比2Gy×5和2Gy×5+cis处理组MDC阳性细胞百分率明显升高，且顺铂处理组高于2Gy×5组（P<0.05）。由此认为，化疗药物顺铂对非小细胞肺癌细胞存活率的影响可能与自噬相关。3不同放疗方案及放疗联合化疗对小鼠肺癌肿瘤大小的影响将处于对数生长期的Lewis肺癌细胞接种于C57BL/6小鼠右后肢皮下，肺癌细胞浓度为1×106/ml，每肢注射量为0.2ml。肿瘤长至合适大小后，将C57BL/6荷瘤鼠随机分为对照组及常规照射组（电离辐射照射每日1次，每次2Gy，共5d，累计照射剂量10Gy）、超分割照射组（每日照射2次，照射间隔4h，每次1Gy，共5d，累计照射剂量10Gy）、联合组（每次2Gy共5d，累计照射剂量为10Gy，且在第1次照射前于小鼠腹腔注射顺铂，浓度为每千克体重小鼠注射顺铂3mg）、单次照射组（一次性给予10Gy剂量照射）。此后，每日测量瘤体大小变化。于照射后第6d杀小鼠取出肿瘤，估测肿瘤体积，数据整理后发现肿瘤体积联合组<超分割组<常规分割<对照组。结果说明，不同的放疗方案对肿瘤细胞的杀伤作用不同，超分割照射的杀伤效果好于常规照射。另外，与单纯放疗相比顺铂联合放疗的肿瘤杀伤效果明显。4不同放疗方案及放化疗联合对细胞自噬相关蛋白的影响为了证实放疗及联合放疗对肿瘤细胞的杀伤过程中自噬发挥了作用，于照射后第6d杀小鼠取出瘤体，收集部分小鼠移植瘤细胞并提取蛋白，并利用Westernblot方法检测其中自噬相关蛋白Beclin1和MAPLC3的表达情况。与对照组相比，超分割组、常规分割和联合组MAPLC3的表达均明显升高，分别增高1.34、2.76和1.59倍，而beclin1表达分别增高2.26、1.5和1.6倍。此结果说明，自噬的确参与了杀伤肿瘤细胞的过程，并发挥了重要作用。其余瘤体10%甲醛固定，石蜡切片后，进行免疫组化染色并观察结果。结果中可见照射组细胞内出现大量棕褐色颗粒（F=34.04，P <0.001），与其它处理组相比联合放疗组中最为明显。数据显示，该组自噬标志性蛋白MAPLC3II表达较别组增加明显，为对照组的4.2倍，而单纯照射组为对照组的3.2倍。PI3KIII和BECLIN1蛋白的表达情况也有所变化，结果显示处理组这两种蛋白的表达较对照组增加，且其中联合放疗组的表达水平差异最明显，为对照组的3.6倍（F=19.79，P <0.001；F=3.509，P <0.05）。表明在应用放疗治疗异位移植瘤的过程中，自噬发挥重要作用。顺铂联合放疗中自噬作用更加明显。且这一过程中PI3KIII和BECLIN1的蛋白表达量均有较大幅度增加，说明PI3KIII/BECLIN1信号通路在联合放疗作用下自噬诱导肺癌细胞死亡中起到重要作用。结论1电离辐射和化疗药物可以诱导非小细胞肺癌细胞株A549和H1299发生自噬。2放射治疗和顺铂联合放疗能够明显抑制非小细胞肺癌异位移植瘤的肿瘤生长。3放射治疗和顺铂联合放疗能够通过自噬发挥肿瘤抑制作用。4分割放射治疗的肿瘤杀伤作用较常规放射治疗强。