论文部分内容阅读
目前肺癌仍高居癌症死亡原因首位。其五年生存率仍只有15%左右,大部分肺癌在诊断时已处于晚期,而肺癌细胞的异常增殖和转移是其中重要的原因之一。其中非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌的85%以上。既往NSCLC增殖和转移研究集中于编码蛋白,然而随着全基因组测序技术的广泛开展,长非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)逐渐进入人们视野。新近研究表明lncRNA在调控细胞分化,凋亡,增殖及细胞侵袭转移等生物学功能中起着重要的作用。陆续发现一些lncRNA在肺癌中的表达异常,可能参与肺癌的发生发展过程。研究显示lncRNA HNF1A-AS1参与食管腺癌的发生发展,但它们在NSCLC中的表达情况及可能的生物学功能尚不清楚,还需进一步研究。而lncRNA GAS5-AS1目前尚无相关文献报道其与肿瘤发生发展的关系。本文第一部分研究了 lncRNA HNF1A antisense RNA1(HNF1A-AS1)在肺腺癌中的表达,对肺腺癌细胞生物学功能的影响及其分子机制。第二部分研究了反义转录的 lncRNA GAS5 antisense RNA 1(GAS5-AS1)在 NSCLC 组织及细胞中的表达水平对NSCLC细胞增殖和侵袭转移能力的影响,及其异常表达的分子机制。以上研究提示lncRNA可作为癌基因或抑癌基因参与介导的复杂RNA调控网络,在NSCLC的发生发展过程中起着重要的作用,为我们研究NSCLC发生发展的分子机制提供了新的思路。第一部分长非编码RNAHNF1A-AS1抑制肺腺癌细胞增殖及侵袭转移的机制研究目的:研究lncRNAHNF1A-AS1在肺腺癌组织及细胞中的差异性表达及其对肺腺癌细胞增殖,周期,凋亡和侵袭转移功能的影响及其分子机制。研究方法:qRT-PCR检测了 HNF1A-AS1在肺腺癌组织中的表达,并分析了其表达水平与患者临床特征的相关性。UCSC Cancer Genomics Browser’s生存分析用来分析HNF1A-AS1的表达与患者预后的关系。MTT,克隆形成,流式细胞技术及皮下瘤移植动物实验检测HNF1A-AS1对细胞增殖,周期及凋亡的影响;Transwell和活体动物实验检测了 HNF1A-AS1对细胞迁移和侵袭转移能力的影响。核质分离检测了 HNF1A-AS1在细胞内定位。生物信息学,ChIP,RIP,Western blot和免疫荧光分析检测了 HNF1A-AS1对下游靶基因的调控。结果:HNF1A-AS1在肺腺癌组织中表达升高,且与TNM分期,肿瘤大小,淋巴结转移相关,UCSC Cancer Genomics Browser’s生存分析提示HNF1A-AS1高表达与患者预后差有关。体内外实验证明下调HNF1A-AS1能抑制细胞增殖,并导致G1期阻滞;HNF1A-AS1的表达下调能抑制细胞的侵袭转移能力。ChIP,RIP,Western blot和免疫荧光结果显示HNF1A-AS1是通过调控肺腺癌细胞的cyclin D1影响细胞周期,通过调控E-cadherin,N-cadherin及β-catenin蛋白表达影响肿瘤细胞的增殖和侵袭转移能力。另外,HNF1A-AS1可能是通过和DNMT1结合而下调E-cadherin的表达。结论:综上所述,本研究提示在肺腺癌中lncRNAHNF1A-AS1可以参与肺癌细胞增殖和转移过程,并可能作为肺腺癌患者预后差的分子标记物。第二部分长非编码RNA GAS5-AS1下调并促NSCLC细胞侵袭转移的机制研究目的:研究1ncRNA GAS5-AS1在NSCLC组织及细胞中的表达水平对细胞增殖和侵袭转移功能的影响及其异常表达的分子机制。研究方法:qRT-PCR检测了 GAS5-AS1在NSCLC组织中的表达,并分析了其表达水平与患者临床特征的相关性。MTT,流式细胞技术检测GAS5-AS1对细胞增殖,凋亡及周期的影响;Transwell检测了 GAS5-AS1对细胞迁移和侵袭转移能力的影响。Western blot检测了 GAS5-AS1对下游靶基因的调控。qRT-PCR探索了组蛋白修饰参与GAS5-AS1异常表达机制。结果:GAS5-AS1在NSCLC组织及细胞中表达下调,并与NSCLC患者的肿瘤大小,TNM分期,淋巴结转移密切相关。NSCLC细胞中过表达GAS5-AS1能抑制细胞侵袭转移能力。Western blot结果显示GAS5-AS1是通过调控NSCLC细胞的上皮-间质转化(EMT)影响细胞的侵袭转移能力。pan-HDAC抑制剂panobinostat和SAHA呈剂量依赖性方式诱导GAS5-AS1。结论:综上所述,本研究提示组蛋白修饰参与表观沉默1ncRNAGAS5-AS1在NSCLC中的转录表达,GAS5-AS1作为EMT的调控因子参与NSCLC细胞的侵袭转移过程。