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目的肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是我国及世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,且发病率呈逐年上升趋势,目前已占所有恶性肿瘤的5%以上。随现代医学的进步,近年尽管已涌现出生物免疫治疗、射频消融、超声聚焦、肝脏移植等一系列新的治疗手段,并取得了一定的疗效,但因HCC恶性程度高,流行病学调查显示出现症状者5年生存率仍不到5%。因此,进一步深入研究HCC发生发展的相关机制,以研发出新的治疗措施及靶点成为目前肿瘤研究的热点。单核-巨噬细胞系统(Mononuclear phagacytic system,MPS)是机体免疫防御的重要组成部分,活化的MPS通过吞噬作用、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(Antibody dependent cell mediated cytotoxicity, ADCC)、分泌细胞因子等途径对肿瘤细胞产生溶解和杀灭作用。Carl von于1886年首先描述肝脏中星形固定的巨噬细胞,并命名为枯否细胞(Kupffer cells, KCs)。KCs是机体最大的巨噬细胞群体,在抑制肿瘤形成、生长及转移过程中均发挥着重要的肿瘤防御作用。因此,本实验拟通过特异性的MPS功能抑制剂氯化钆(Gadolinium chloride, GdCl3)抑制KCs功能后,观察其对昆明小鼠实验性肝癌生长的影响,进一步证实KCs在HCC发生发展中的防御作用,并探讨相关机制,为研发出新的治疗措施及靶点提供依据。方法60只25±5g的4W雄性健康昆明小鼠,经右肝前叶包膜下接种0.2ml (2×105) H22细胞悬液制备实验性肝癌模型,并随机分成两组(各30只):Gdcl3预处理组(Gadolinium chloride treatment group, GCG)于接种H22细胞前1W开始,1次/3d自尾静脉注入浓度为0.25﹪的Gdcl3溶液10mg/Kg;肝癌组(Hepatocellular carcinoma group, HCCG)于接种H22细胞前1W开始,1次/3d自尾静脉注入0.2ml生理盐水。同时以20只未作任何处理的同龄健康昆明小鼠为正常对照组(Normal control group, NCG)。以Gdcl3预处理组、肝癌组及正常对照组各10只,在实验观察期60d内,绘制生存曲线; Gdcl3预处理组(20只)和肝癌组(20只),于接种H22细胞3W后处死,并以未作任何处理的小鼠10只作为正常对照组,分别测定:肿瘤组织质量;光镜下观察肿瘤组织生长情况,电镜下观察KCs超微结构;免疫组织化学染色鉴定肝脏及肿瘤组织KCs并观察其分布范围和及计数;酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定血清TNF-α水平;逆转录多聚酶链式反应( Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR )测定肝脏TNF-αmRNA表达水平。结果⑴SPSS13.0统计软件分析绘制Kaplan-Meier生存曲线,结果显示:观察期内(60d)正常对照组小鼠无死亡;肝癌组与Gdcl3预处理组生存时间分别为: 40.5±3.5d和30.5±2.5d,3组生存时间逐渐缩短,Log-rank时序检验表明差异具有显著性(P <0.05)。⑵H22肿瘤细胞接种3W后,肉眼观察Gdcl3预处理组癌灶的体积明显大于肝癌组,两者质量分别为1.56±0.14g及3.18±0.25g,差异具有显著性(P<0.05)。⑶HE染色显示光镜下可见正常对照组肝小叶形态结构正常,汇管区和中央静脉结构清晰,细胞索排列规律。肝癌组和Gdcl3预处理组均可见癌组织细胞排列紊乱,异型性明显,癌旁肝组织有较多KCs浸润,但是Gdcl3预处理组肿瘤浸润面积更大且可见卫星结节。⑷电镜观察发现正常对照组肝脏KCs形态良好,胞浆内吞噬溶酶体少,吞噬活性无明显增强。肝癌组癌旁组织肝血窦中KCs胞质吞噬体和溶酶体增多,核明显肿大增大不规则,胞质内可见大量内质网,并可见胞膜与癌细胞膜相连;Gdcl3预处理组KCs则没有明显激活的表现。⑸免疫组织化学染色显示KCs呈卵圆形、星形或纺锤形;细胞计数表明肝癌组癌旁肝组织和远癌肝组织中KCs数量分别为9.40±2.37个/HP、9.50±2.17个/HP;Gdcl3预处理组的癌旁肝组织和远癌肝组织中KCs数量为9.20±1.87个/HP、9.08±2.10个/HP;正常对照组的肝组织中KCs数量为4.80±1.31个/HP;虽然在Gdcl3预处理组、肝癌组的癌旁肝组织及远癌肝组织的KCs数量较正常肝组织明显增加(P<0.01),但两者之间差异无显著性(P>0.05)。⑹ELISA测定正常对照组、Gdcl3预处理组及肝癌组各组小鼠血清TNF-α水平分别为:1.635±0.237ng/L、3.964±0.205 ng/L和4.977±0.357ng/L,Gdcl3预处理组和肝癌组TNF-α水平明显高于正常对照组(P<0.01),同时肝癌组又明显高于Gdcl3预处理组(P<0.01); RT-PCR半定量结果分析显示,肝组织TNF-αmRNA表达水平在正常对照组、Gdcl3预处理组与肝癌组逐渐升高,其相对含量分别为1.6、3.5和8.0,差异有显著性(P<0.05)。结论⑴Gdcl3预处理虽然对KCs的数量没有影响,但明显抑制KCs功能;⑵KCs功能抑制致TNF-α产生减少,机体肿瘤免疫机能明显下降,从而肿瘤生长加速并易于转移,导致试验小鼠生存时间缩短;⑶加强对KCs的保护肝细胞、抑制其恶性转化的功能研究,将是今后进一步研究的重点和热点。