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背景:本论文为2009年度国家自然基金面上项目“野菊花中萜类和黄酮类化合物抗乙肝病毒活性协同作用机制研究(编号:30973872)”课题研究内容。野菊花是一种资源丰富,药理功效多样的传统中药。课题组对产自河南信阳的野菊花进行提取分离,并经过工艺优化筛选,得到一个野菊花抗乙肝病毒和肝保护活性较好部位,为FCIB。
目的意义:本文将对前期试验得到的野菊花FCIB部位进行质量标准和溶解性能的研究。以期完善FCIB和野菊花质量标准,了解FCIB溶解特点,为FCIB的开发利用提供参考。
方法:利用反相高效液相色谱结合液相-高分辨质谱联用法,以蒙花苷为参比峰,研究确定建立FCIB指纹图谱的方法;以豚草素A、当归酰豚草素B、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、刺槐素为研究对象,利用RP-HPLC双波长法建立同时测定FCIB中6个主要成分含量的方法;以豚草素A、当归酰豚草素B为研究对象,分别建立HPLC-UV和HPLC-ELSD对野菊花中倍半萜含量测定的方法;以沉淀法和指标物质溶解量法对FCIB、FCIT(总萜)、FCIH(总黄酮)分别在水、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇中的溶解性能进行研究。
结果:
(1)建立了FCIB的HPLC指纹图谱方法,测定不同年份得到的三批FCIB样品,共得到达到基线分离的19个共有峰,并指认了其中的10个特征峰,分别为:(3R,5R,6S,7S,10R-7-(2-hydroxy-2-propyl)-10-methyl-4-methylen eperhy,dronaphthal ene3,5,6-triol acetone solvate(1);(+)-edusmance4,(14)-ene-11,13-diol(2);蒙花苷(3);木犀草素(4);芹菜素(5);麦黄酮(6);5,3,4-三羟基-6,7-二甲氧基黄酮(7);豚草素A(8);刺槐素(9);当归酰豚草素B(10)。其中化合物3、4、5、6、7、9为黄酮及其苷类,化合物1、2、8、10为倍半萜类,为首次在野菊花中被指认。
(2)建立了FCIB中6个主要成分同时含量测定的RP-HPLC方法。对FCIB中的豚草素A、当归酰豚草素B、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、刺槐素进行含量测定,这6个化合物分别在0.0060~0.1200mg.ml-1(r2=0.9996),0.0074~0.1478mg.ml-1(r2=0.9997),0.00170~0.1720mg.ml-1(r2=0.9997),0.0068~0.1373 mg.ml-1(r2=0.9992),0.00690~0.1386 mg.ml-l(r2=0.9997),0.0040~0.0800 mg.ml-1(r2=0.9999)内与峰面积呈良好的线性关系,加样回收率(n=9)分别为100.8%(RSD=2.0%),95.0%(RSD=0.4%),102.7%(RSD=1.4%),96.5%(RSD=1.4%),97.5%(RSD=1.2%),99.8%(RSD=1.8%)。
(3)建立了HPLC-UV和HPLC-ELSD同时测定野菊花中豚草素A和当归酰豚草素B的方法。HPLC-UV测得豚草素A和当归酰豚草素B分别在2.87~57.4μg.ml-1(r2=1),2.6~52.0μg.ml-1(r2=0.9998)内与峰面积呈良好的线性关系,加样回收率(n=9)分别为98.66%(RSD=2.05%),99.11%(RSD=2.67%);HPLC-ELSD测得豚草素A和当归酰豚草素B分别在28.7~574μg.ml-1(r2=1),26~520μg.ml-1(r2=0.9997)内与峰面积呈良好的线性关系,加样回收率(n=9)分别为97.65%(RSD=2.05%),96.03%(RSD=1.97%)。分别用两种方法对四批采自不同年份的野菊花药材进行测定,所得结果相差不大,但HPLC-UV灵敏度更高,操作更为简便。
(4) FCIB、FCIT、FCIH均在50%乙醇溶液中溶解度最大,且FCIT、FCIH在溶解时存在着一定的相互影响。
结论:首次利用液质联用法建立了FCIB的HPLC指纹图谱;首次利用RP-HPLC双波长法建立了同时测定FCIB中6种活性成分的方法学;首次利用两种不同的检测方法对野菊花中倍半萜类成分进行含量测定;首次利用沉淀法和指标物质溶解量法对FCIB溶解性能进行研究,确定了FCIB的溶解性能和特点。