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乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，在发达国家占女性恶性肿瘤的第一位。乳腺癌的基因治疗是除了外科手术、化疗和放疗的另一个很有前景的治疗方式，它能将肿瘤抑制基因、抑癌因子或其他抗癌药物直接送达肿瘤部位靶向杀伤肿瘤细胞，因而备受学者关注。乳铁蛋白(Lactoferrin，LTF)具有抗肿瘤作用，能明显抑制多种器官肿瘤的发生、生长和转移，被广泛认为是一种新型的抗癌药物。在前期的研究工作中，我们构建了含有人乳铁蛋白cDNA和绿色荧光蛋白基因(GFP)作为报告基因的重组人乳铁蛋白腺病毒载体(ad-rhLTF)，并证明ad-rhLTF在羊乳汁和兔乳汁中均获得人LTF(hLTF)的高表达。然而，有关ad-rhLTF的其他生物学活性尤其对乳腺癌的作用及机制仍然不十分清楚。因此，本研究采用体内、体外试验，较系统地研究了ad-rhLTF对乳腺癌的作用及其抑癌机制。在体内试验中，首先建立小鼠EMT6乳腺癌移植瘤模型，并随机分为阴性对照组、环磷酰胺阳性药物对照组、ad-rhLTF低剂量组(108pfu/mL)和ad-rhLTF高剂量组(5×10~8pfu/mL)。采用免疫组织化学法、ELISA、流式细胞技术、RT-PCR、Western blot方法等，对ad-rhLTF可能的抗乳腺癌作用及机制从调节免疫功能、干扰肿瘤细胞周期以及诱导肿瘤细胞凋亡等方面进行了系统地研究。获得如下结果：Ad-rhLTF不同剂量肿瘤注射14d后，发现hLTF在小鼠肿瘤组织中出现高表达,以高剂量组更为明显。Ad-rhLTF低、高剂量均能明显地抑制小鼠肿瘤的生长(p<0.01)，肿瘤抑制率分别为42.80%和52.64%。并证明ad-rhLTF减少了肿瘤组织中突变型p53、CerbB-2和Ki-67蛋白的阳性细胞百分率(p<0.01)，且肝脏、肾脏组织形态及功能均未见异常。通过对肿瘤细胞周期分析，ad-rhLTF能增加肿瘤细胞在G0/G1期的数目(p<0.01)，减少S期和G2/M期的百分数(p<0.01)，并出现Sub-G1期凋亡峰，凋亡百分数达到19.58%(ad-rhLTF高剂量组)，证明ad-rhLTF通过干扰细胞周期发挥抗肿瘤作用。同时，小鼠肿瘤组织中Bcl-2mRNA和蛋白表达均减少(p<0.01)，而Bax、Fas、Caspse3mRNA和蛋白表达均明显增加(p<0.01)，证明ad-rhLTF诱导凋亡是通过启动了凋亡的线粒体途径和死亡受体途径进而引起caspase3的活化。试验也发现，ad-rhLTF处理组肿瘤组织中p53mRNA表达增加，PKB和PKC蛋白表达减少(p<0.01)，证明p53、PKB和PKC参与调节凋亡过程。通过对小鼠免疫功能的研究发现，ad-rhLTF高剂量明显地提高了荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数(p<0.05)，而ad-rhLTF低剂量对胸腺指数和脾指数无显著影响(p＞0.05)。Ad-rhLTF增强腹腔巨噬细胞的吞噬能力和NK细胞的杀伤活性(p<0.05，p<0.01)，刺激小鼠脾细胞增殖(p<0.01)，增加了外周血CD4+T细胞的比例(p<0.05)，有效地纠正了肿瘤发生时CD4+T与CD8+T细胞比例的倒置。刺激小鼠脾细胞分泌IL-2、腹腔巨噬细胞分泌TNF-α (p<0.05)。外周血单个核细胞(PBMC)中的IL-2、TNF-α的mRNA表达水平上升(p<0.01)，血清中的IL-2和TNF-α表达增加(p<0.05)，从而发挥细胞因子的抗肿瘤作用。此外，ad-rhLTF处理组PBMC中B7-1和B7-2分子mRNA表达上调(p<0.01)，脾细胞核转录因子NF-κB和AP-1高表达(p<0.01)，则促进T细胞克隆增殖，增强了抗肿瘤免疫。在MCF-7细胞体外培养试验中，ad-rhLTF作用于MCF-7细胞72h的IC50为100pfu/cell。Ad-rhLTF转染MCF-7细胞72h后, ad-rhLTF对MCF-7细胞具有明显的细胞毒作用，抑制了MCF-7细胞的增殖，并且经光镜、荧光染色和电镜观察MCF-7细胞出现了典型的凋亡形态学特征。经过Annexin V-FITC流式检测，ad-rhLTF明显增加MCF-7的凋亡细胞数，凋亡率达到31.92%(100pfu/cell)。细胞经琼脂糖凝胶电泳出现DNA“梯状”条带，细胞线粒体膜电位显著下降。Ad-rhLTF阻滞MCF-7细胞周期在G0/G1期。Ad-rhLTF也导致了Bcl-2mRNA的减少和Bax mRNA表达的增加(p<0.01)，从而证明ad-rhLTF诱导MCF-7的凋亡机制与线粒体途径有关。本文通过体内、外试验对ad-rhLTF的抗乳腺癌的作用及相关机制进行了较深入地研究，为ad-rhLTF在肿瘤靶向治疗领域的应用提供了理论基础。