论文部分内容阅读
脂肪酶即三酰甘油酯水解酶（E.C.3.1.1.3）,是一类催化甘油三酯水解产生甘油和游离脂肪酸的酶。脂肪酶催化反应时具有良好的化学选择性、区域选择性和立体选择性,且不需要辅因子,反应条件温和,因此是工业应用中一类非常有吸引力的酶,被广泛应用在化工、医药、食品、洗涤剂、生物燃料、造纸、皮革等行业中。本论文通过以重要的手性化合物α-硫辛酸、薄荷醇和1-苯乙醇为底物,筛选出具有高立体选择性的脂肪酶AOL,该酶来源于本实验室从土壤中分离得到的米曲霉菌株Aspergillus oryzae WZ007。对A.oryzae WZ007脂肪酶光学选择性催化拆分（RS）-1-苯乙醇、不对称催化C-C键形成的aldol反应进行了研究,并对该酶进行了分离纯化以及酶学性质的研究。论文以3种重要的手性化合物为底物,筛选出具有高立体选择性的A.oryzae WZ007脂肪酶为研究对象。进一步研究利用A.oryzae WZ007所产的两种形态的脂肪酶——菌丝结合酶和表面活性剂修饰的胞外游离酶光学选择性拆分（RS）-1-苯乙醇。考察了菌丝结合酶拆分（RS）-1-苯乙醇最佳反应条件,酰基供体为乙酸乙烯酯、反应溶剂为甲基叔丁基醚、乙酸乙烯酯与（RS）-1-苯乙醇的摩尔比为1:1、反应温度为30°C、酶浓度为60 g/L,在此条件下,当底物浓度低于1.4 M时,反应的最终转化率皆可达46%以上。当底物浓度为1.8 M时,反应的最终转化率亦可达40%左右,产物（R）-乙酸-1-苯乙酯的光学纯度>99%,反应时空产率约为7.5 mmol/L·h。论文研究了表面活性剂修饰A.oryzae WZ007胞外游离脂肪酶用于拆分（RS）-1-苯乙醇。对修饰条件进行了优化,表面活性剂为吐温-40,有机助溶剂为四氢呋喃,在磷酸盐缓冲液（0.1 M,p H 7.0）中,混合发酵液（50 m L）与吐温-40（0.3 g,溶于四氢呋喃）,产生的酶-表面活性剂复合物（LSC）冻干后用于催化拆分（RS）-1-苯乙醇。LSC亦在甲基叔丁基醚以及30°C条件下具有最佳的催化性能,当底物浓度为0.1 M、酶浓度为10 g/L时,反应2 h转化率即达48%,时空产率约为24 mmol/L·h。与菌丝结合酶相比（时空产率7.5 mmol/L·h）,催化活性显著提高。论文对A.oryzae WZ007脂肪酶应用于催化C-C键形成的aldol反应,证明了该酶具有催化多功能性,而且催化该反应亦具有立体选择性。对催化对硝基苯甲醛和环己酮的aldol反应的条件进行了优化,当底物浓度为0.1 M,反应体系含水量为5%,环己酮与对硝基苯甲醛的摩尔比为35:1,反应溶剂为乙腈,加酶量为20 mg/m L,在30°C条件下反应60 h时,底物转化率可达95%以上,产物的非对映体选择性dr（anti/syn）可达82:18,反式异构体过量值（ee（anti））可达80%。论文采用硫酸铵沉淀、Hiprep 16/10 Octyl疏水层析、Q-Sepharose离子交换层析和Superdex TM 75 10/300 GL凝胶过滤的方法对A.oryzae WZ007脂肪酶进行了分离纯化。纯化后的蛋白在SDS-PAGE图谱上呈现单一蛋白条带,分子量约为25 k Da。对纯化后的酶进行了MALDI-TOF/TOF质谱鉴定,获得的肽段的氨基酸序列与来源于A.oryzae RIB410和Aspergillus flavus NRRL3357的脂肪酶或角质酶的部分肽段具有很高的匹配度。纯化的酶能有效地催化拆分（RS）-1-苯乙醇和催化对硝基苯甲醛和环己酮的aldol反应。对纯化的A.oryzae WZ007脂肪酶进行了酶学性质的研究,该酶的最适p H为7.5,在p H7.0～8.5范围内稳定;最适温度为40°C,在30°C以内非常稳定。Mg2+、Na+、K+、Li+、NH4+、Mn2+和Co2+对A.oryzae WZ007脂肪酶的活性基本没有影响;Ca2+和Cu2+对A.oryzae WZ007脂肪酶的活性有轻微的抑制;10 m M的Ag+和阴离子表面活性剂SDS可使酶完全失活;非离子型表面活性剂吐温-80显著促进了A.oryzae WZ007脂肪酶的活性;阴离子去垢剂脱氧胆酸钠对A.oryzae WZ007脂肪酶活性具有轻微的促进作用;还原剂二硫苏糖醇、β-巯基乙醇以及金属离子螯合剂EDTA对A.oryzae WZ007脂肪酶活性基本无影响。A.oryzae WZ007脂肪酶对具有短链脂肪酸的对硝基苯酯如对硝基苯乙酸酯（p-NPA）具有高活性;对具有长链脂肪酸的三酰甘油酯如三油酸甘油酯具有高活性,而对具有短链脂肪酸的三酰甘油酯以及不同脂肪酸链长的脂肪酸乙酯具有较低的活性。A.oryzae WZ007脂肪酶以p-NPA为底物的酶动力学参数Km和Vm分别为25.33 mmol/L和0.37mmol/L·min。论文证实了铵盐对用于分析脂肪酶/酯酶活性的底物对硝基苯乙酸酯（p-NPA）和对硝基苯丁酸酯（p-NPB）的自发水解有促进作用。水解速率随p H、温度以及铵盐浓度增加而增加。研究了不同饱和度的硫酸铵溶液对分析Candida antartica脂肪酶（Nov 435）活性的影响,当硫酸铵饱和度小于40%时,分析结果偏差不大,但当硫酸铵饱和度大于40%时,分析结果偏差逐渐增加。因此当用该法分析脂肪酶/酯酶活性时,若酶液中存在低浓度的铵盐时,需设置对照;而当酶液中存在高浓度的铵盐或无法预知含何种浓度的铵盐时,需去除铵盐后方能测定。