研究背景:视网膜是人体唯一可以将可见光转换成电神经脉冲,传递到大脑皮层,形成视觉的神经组织。长期过量的光照会造成视网膜严重损伤,特别会导致视网膜感光细胞和视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的损伤,临床上称之为视网膜光损伤。然而随着科技的飞速发展,许多电子屏产品和高照度的眼科设备得到了广泛的应用,视网膜光损伤问题越来越受到人们的重视,因此探究视网膜光损伤的分子机制尤显迫切。光化学损伤是光诱导视网膜损伤的最常见形式,在视网膜光损伤中占有主导地位。可见光中过量的光子被视网膜感光细胞及RPE细胞的光敏物质吸收后,通过一系列光化学反应,产生大量活性氧物簇(reactive oxygen species,ROS),如单线态氧、超氧化物和过氧化氢等。细胞内过多的ROS可诱导光感受器细胞及RPE细胞发生氧化应激损伤。而内质网作为介导蛋白质合成、加工和转运的重要细胞器,若细胞内氧化还原失衡,可能会破坏内质网蛋白折叠机制,从而产生大量错误折叠的蛋白质,导致细胞发生内质网应激。根据以上信息我们提出假说,在视网膜光损伤中,可能会发生内质网应激而氧化应激则是导致内质网应激的上游因素。自噬是真核细胞中一种主要的降解系统,参与长寿命蛋白质、细胞器和其他细胞内容物的降解。此外,自噬作为内质网相关降解(endoplasmic reticulumassociated degradation,ERAD)途径的一个重要机制,同时参与内质网应激时错误折叠蛋白和蛋白聚集体的降解。通常自噬被认为是一种细胞生存机制,然而过度激活的自噬也诱导细胞死亡,被称为“自噬性细胞死亡”。在国际上自噬在视网膜光损伤中的作用是有争议的。有报道发现自噬通过降解活化的视紫红质而发挥神经保护作用,并抑制光依赖性视网膜变性。相反也有研究曾表明过度激活自噬对光感受器细胞是有害的,抑制自噬可以保护光感受器细胞免受光损伤。因此,进一步阐明自噬在视网膜光损伤中的作用仍然是非常有必要的课题,并且在视网膜光损伤中自噬是否受内质网应激相关通路的调节还需要进一步的探究。以往的研究表明,可见光诱导的损伤主要发生在视网膜外层,特别是感光细胞和RPE细胞层。因此,本研究以光感受器细胞(661W)和RPE细胞(ARPE-19)两种细胞系为研究对象,通过体外实验探究光诱导细胞死亡的分子机制。在体内实验,我们特别关注视网膜外层和RPE细胞层,分别测定视网膜及RPE/脉络膜光损伤时的变化,进一步探讨抑制内质网应激性自噬在视网膜光损伤中的作用。目的:1.建立细胞光损伤模型,检测光感受器细胞或RPE细胞光损伤时的氧化还原状态。用氧化应激抑制剂N-acetyl-L-cysteine(NAC)处理细胞,探讨抑制氧化应激在细胞光损伤中的作用。2.检测光感受器细胞或RPE细胞内质网应激相关蛋白的表达,验证光损伤时是否激活内质网应激。另外,用内质网应激抑制剂Salubrinal(SAL)处理细胞,研究抑制内质网应激在细胞光损伤中的作用,并进一步探讨光损伤时氧化应激与内质网应激的上下游关系。3.建立光感受器细胞或RPE细胞光损伤模型,检测自噬标志性蛋白的表达,验证过度光照对自噬的影响,并通过抑制自噬探讨自噬在光损伤中的作用。4.用SAL抑制内质网应激,评估自噬标志性蛋白表达水平,初步探讨光损伤时内质网应激是否调节自噬。建立661W细胞的PERK敲低细胞株,用PERK特异性抑制剂GSK2606414(GSK)处理ARPE-19细胞,探讨光感受器细胞或RPE细胞发生光损伤时,内质网应激的PERK通路是否与自噬激活相关。5.通过体内实验,进一步探究抑制内质网应激性自噬在视网膜光损伤中的作用。方法:1.检测氧化应激在光感受器细胞和RPE细胞光损伤中的作用(1)分别将661W细胞或ARPE-19细胞暴露于1500Lux的可见光下1-3天。通过Western Blot检测氧化应激相关蛋白HO-1的表达。(2)用氧化应激抑制剂NAC处理细胞,通过活性氧ROS染色、glutathione(GSH)、oxidized glutathione(GSSG)检测、Western Blot及PI/Hoechst染色等方法检测抑制氧化应激在光感受器细胞或RPE细胞光损伤中的作用。2.检测内质网应激在光感受器细胞和RPE细胞光损伤中的作用(1)将661W细胞或ARPE-19细胞暴露于1500Lux的可见光下1-3天,通过Western Blot检测内质网应激相关蛋白的表达水平。(2)给予细胞内质网应激抑制剂SAL,通过PI/Hoechst染色及Western Blot检测光损伤下SAL对661W细胞或ARPE-19细胞死亡率及内质网应激相关蛋白表达的影响。(3)用NAC处理细胞,通过Western Blot检测抑制氧化应激对内质网应激相关蛋白表达的影响,以明确氧化应激与内质网应激的关系。3.观察光损伤时自噬是否活化并检测其在光感受器细胞及RPE细胞中的作用(1)以上方法建立细胞光损伤模型,应用Western Blot检测自噬标志性蛋白BECN1及LC3BII的表达水平。用Hydroxychloroquine(HCO)分别处理661W细胞及ARPE-19细胞,以破坏溶酶体的酸性,通过Western Blot检测阻断自噬体降解对LC3BII及P62蛋白表达的影响。(2)用自噬抑制剂3-methyladenine(3MA)处理细胞,通过Western Blot及PI/Hoechst染色检测光损伤条件下抑制自噬对自噬标志性蛋白表达及细胞死亡率的影响。4.探讨内质网应激与自噬的关系(1)用SAL分别处理661W细胞及ARPE-19细胞,通过Western Blot检测自噬标志性蛋白的表达水平,验证光照条件下抑制内质网应激对自噬的影响。(2)用慢病毒介导的sh RNA抑制661W细胞PERK的表达或用PERK特异性抑制剂GSK处理ARPE-19细胞。应用Western Blot、m Cherry-GFP-LC3B腺病毒观察自噬和PI/Hoechst染色等方法检测光损伤时PERK信号是否激活自噬及抑制PERK信号对细胞死亡率的影响。5.探究抑制内质网应激性自噬在视网膜光损伤中的作用将6周龄的雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组,SAL治疗组,光损伤组及光损伤SAL治疗组。SAL治疗组及光损伤SAL治疗组的小鼠以1mg/kg的剂量腹腔注射SAL,每日1次,连续注射7天。另外两组腹腔注射等体积的含有1%二甲基亚砜生理盐水。于腹腔注射第3天,光损伤组及光损伤SAL治疗组的小鼠用1%阿托品扩张瞳孔,置于7000Lux可见光下连续照射12小时。光照后,将小鼠继续在正常光/暗循环的动物室内喂养。光暴露后第5天腹腔注射过量戊巴比妥钠对小鼠施行安乐死,摘除眼球用于后续研究。通过HE染色观察视网膜结构变化,用Western Blot法检测内质网应激相关蛋白、自噬标志性蛋白、光感受器标志性蛋白视紫红质及RPE细胞标志性蛋白RPE65的表达水平,探讨抑制内质网应激性自噬对视网膜光损伤的神经保护作用。结果:1.661W细胞或ARPE-19细胞分别光照1-3天后,与对照组相比氧化应激相关蛋白HO-1在细胞内的表达显著增高并在光照的第3天达到高峰。与光损伤组相比,用NAC(661W细胞为5m M,ARPE-19细胞为2.5m M)处理细胞,能够抑制光诱导的ROS增高,逆转GSH/GSSG的比值下降,并显著降低HO-1的表达水平。最重要的是用NAC处理细胞显著降低了光损伤下的细胞死亡率。以上结果提示过度光暴露导致光感受器细胞和RPE细胞发生严重氧化应激损伤,其可能是触发细胞死亡的上游步骤。2.检测内质网应激相关蛋白。与对照组相比,光损伤组661W细胞及ARPE-19细胞中cleaved-ATF6、p-IRE1a/IRE1a、p-PERK/PERK、p-EIF2a/EIF2a、ATF4和CHOP的水平显著升高,并于光照的第3天达到高峰。与光损伤组相比,SAL(661W细胞:20μM;ARPE-19细胞:10μM)处理细胞可显著降低细胞死亡率,抑制光损伤时内质网应激相关蛋白的表达。另外,与光损伤组相比,用抗氧化剂NAC处理细胞,在光照的第3天显著降低了cleaved-ATF6、p-IRE1a/IRE1a、p-PERK/PERK、p-EIF2a/EIF2a、ATF4和CHOP的水平。以上结果说明过度光暴露激活了光感受器细胞和RPE细胞的内质网应激,而光诱导的氧化应激可能是死亡级联中内质网应激之前的上游步骤。3.与对照组相比,在661W细胞或ARPE-19细胞暴露于光下1-3天后,光损伤组BECN1和LC3BII的水平均随着光照时间的延长逐渐升高。用HCO(20μM)处理细胞阻断自噬流后,661W细胞或ARPE-19细胞LC3BII的含量及P62的水平升高。而用3MA(661W细胞:2.5m M;ARPE-19细胞:1m M)处理细胞后能显著降低光诱导的BECN1及LC3BII的水平,并降低细胞死亡率。因此,这些结果表明过度光暴露导致光感受器细胞及RPE细胞发生了过度自噬,而光损伤时抑制过度活化的自噬对细胞具有神经保护作用。4.用SAL分别处理661W细胞或ARPE-19细胞后,显著降低了光损伤时BECN1及LC3BII蛋白的表达。并且无论是慢病毒介导sh RNA抑制661W细胞PERK的表达,还是用PERK特异性抑制剂GSK(5μM)处理ARPE-19细胞,均明显抑制光损伤时内质网应激的PERK通路,抑制BECN1和LC3BII蛋白的表达。并且抑制PERK通路能够显著减少光照条件下自溶体的数量,降低661W细胞和ARPE-19细胞的死亡率。该部分研究说明通过抑制内质网应激的PERK信号可以抑制光诱导的过度自噬,而光损伤下抑制内质网应激性自噬对光感受器细胞和RPE细胞具有保护作用。5.组织学分析表明,过度光照导致视网膜ONL层结构紊乱、变薄,RPE层发生断裂,而SAL注射则减弱了光损伤对视网膜结构的破坏。另外,与对照组相比,12小时的强光照射使视网膜或RPE/脉络膜混合物样本中内质网应激相关蛋白cleaved-ATF6、p-IRE1a/IRE1a、p-PERK/PERK、p-EIF2a/EIF2a、ATF4、CHOP及自噬标志性蛋白BECN1、LC3BII的水平显著升高。腹腔注射SAL可明显抑制光损伤时内质网应激和自噬标志性蛋白的表达。并且,强烈的光暴露导致光感受器标志性蛋白视紫红质和RPE细胞标志性蛋白RPE65的表达下降。而与光损伤组相比,SAL注射显著逆转了光损伤下这两种标记物的丢失。提示抑制内质网应激可抑制过度激活的自噬,以抵御视网膜光损伤。结论:氧化应激、内质网应激和自噬都与光损伤诱导的光感受器细胞和RPE细胞死亡有关。作为上游信号,过度光暴露诱导的氧化应激导致细胞氧化还原状态失衡,并严重干扰内质网蛋白质的折叠过程,进一步触发光感受器细胞和RPE细胞中的内质网应激。而发生光损伤时通过PERK信号抑制内质网应激可抑制过度自噬,对光感受器细胞和RPE细胞具有保护作用。并且通过体内实验发现抑制内质网应激诱导的自噬在视网膜光损伤中发挥神经保护作用。