东南景天铜/锌超氧化物歧化酶基因的分离与功能分析

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东南景天(Sedum alfredii Hance)是我国东南部地区古老Pb/Zn矿区发现的一种新的镉超积累植物,本论文以超积累生态型东南景天为植物材料,采用生物信息学分析方法、实时荧光定量PCR技术、转基因技术等技术方法,分离出东南景天铜/锌超氧化物歧化酶基因cDNA全长,并对其功能进行了初步验证,具体实验结果如下:  1.从东南景天转录组数据中筛选出一个和耐镉相关的基因Cu/Zn SOD,通过PCR克隆获得cDNA全长和基因组DNA全长,命名为SaCu/Zn SOD,该基因cDNA全长为1001 bp,其中ORF为633 bp,编码210个氨基酸,将序列提交到NCBI上,登录号为KF806556,序列分析显示该基因含有7个内含子。  2.亚细胞定位软件分析显示东南景天Cu/Zn SOD蛋白定位于叶绿体中,氨基酸序列比对结果显示Cu/Zn SOD保守性较高,Cu2+和Zn2+结合位点高度保守,进化树分析显示Cu/Zn SOD大致上以草本和木本为界限聚为两类。  3.构建SaCu/Zn SOD的原核表达载体pYES2G-Cu/Zn SOD,转入大肠杆菌BL21Star(DE3)中,0.8 mM.L-1 CdCl2胁迫条件下绘制生长反应曲线,同时进行点板实验,结果显示含SaCu/Zn SOD基因的转化子生长状况优于空载转化子,证明外源基因的导入提高了大肠杆菌的耐镉性。  4.分别提取不同重金属胁迫后东南景天根、茎、叶的RNA,利用RT-qPCR技术,对SaCu/Zn SOD基因在400μmol.L-1 Cd2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+重金属胁迫后的组织特异性表达进行分析,结果显示SaCu/Zn SOD在茎和叶中表达量高于根部表达量,其表达对不同的金属响应模式不同:Cd2+胁迫后茎和叶中表达量迅速上调,推测东南景天地上部能够积累一定量的Cd2+; Cu2+胁迫0.5h时根部SaCu/Zn SOD基因表达量就显著上调,推测该基因为Cu2+的前期响应基因;Zn2+胁迫后根、茎、叶表达量达到最大值分别为48 h、72 h和72 h,说明SaCu/ZnSOD响应Zn2+较慢;而对Pb2+的响应,在根、茎、叶中没有呈现特定的规律。  5.构建植物表达载体pBI121G-Cu/Zn SOD,通过浸花法转化拟南芥,提取转基因拟南芥DNA和RNA,验证插入片段及基因表达量,随后以5mM.L-1 CdCl2处理拟南芥,测定生理指标,并在含镉平板上测定转基因拟南芥种子和野生型拟南芥的发芽率,实验结果均显示转基因拟南芥耐镉性高于野生型拟南芥,说明SaCu/Zn SOD基因的表达提高了转基因拟南芥对镉胁迫的抗性。
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