近年来,养殖户为了追求经济效益,不断加大放养密度,增加投喂量,以及在鱼类饲料中大量使用植物蛋白原料,鱼类肠道健康受到很大冲击,肠炎频发,肠道消化不良导致饵料系数升高的问题非常突出,严重影响了养殖效益。肠道健康问题已成为制约我国水产养殖业持续健康发展的瓶颈之一。益生菌能改善鱼类肠道菌群结构和肠道健康,在水产养殖中的应用受到广泛关注。近年越来越多的证据表明,益生菌能激活鱼类肠黏膜免疫系统,诱导抗菌肽等效应分子的表达,维持肠道稳态,但相关分子机制尚不清楚。本试验以花鲈为研究对象,建立原代肠上皮细胞模型,探究芽孢杆菌调节花鲈肠道抗菌肽表达的分子机制。试验内容包括3部分:1.花鲈肠道上皮细胞（IECs）的分离培养和鉴定本试验的主要目的是建立一种稳定、可重复的花鲈IECs的原代培养方法。首先,比较胰蛋白酶和胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化液的分离效果;然后,选取约10 g和90 g的花鲈,分别采用组织块法和胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化法分离和体外培养肠道上皮细胞,最后,采用形态学观察、透射电镜观察和碱性磷酸酶染色进行鉴定。结果表明,胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化液对花鲈IECs的分离效果较好,且消化45 min时分散效果最佳。组织块法培养的原代细胞形态差异较大,且耗时较长;酶消化法能较快的获得形态均一的原代细胞。酶消化法培养得到的原代细胞2天后汇合成片,成铺路石样,边界清晰,互不重叠,经形态学观察、透射电镜鉴定和碱性磷酸酶染色确定为肠道上皮细胞。综上,选取90 g左右的花鲈,采用胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化所得到的肠道上皮细胞,静置于恒温细胞培养箱中培养2天后,能得到生长旺盛,形态均一的原代肠道上皮细胞。2.芽孢杆菌诱导花鲈IECs内抗菌肽表达的研究用不同浓度的暹罗芽孢（Bacillus siamensis）LF4杆菌刺激IECs 3 h后,筛选出芽孢杆菌诱导抗菌肽表达的最适浓度;然后用最适浓度的暹罗芽孢杆菌刺激IECs不同时间（0、1、3和6 h）后筛选芽孢杆菌诱导抗菌肽表达的最适时间;用1×108 CFU/m L（最适浓度）暹罗芽孢杆菌活菌、灭活菌和菌培养上清液刺激IECs 3 h（最适时间）,检测生化指标和抗菌肽水平。结果表明:1×108 CFU/m L暹罗芽孢杆菌刺激IECs 3 h时,细胞培养上清液中LDH、GOT和GPT活性最低,且显著低于对照组（P<0.05）。1×108 CFU/m L暹罗芽孢杆菌刺激IECs 3 h时,细胞培养上清液中AKP活性及β-defensin的含量显著高于对照组（P<0.05）,细胞内Na+K+-ATP酶活性及β-defensin、Hepcidin-1、NK-lysin和Piscidin-5基因的相对表达量显著高于对照组（P<0.05）。芽孢杆菌活菌和灭活菌均能显著降低细胞培养上清液中LDH、GOT和GPT活性（P<0.05）。芽孢杆菌活菌和灭活菌组细胞培养上清液中AKP活性及β-defensin的含量显著高于对照组（P<0.05）。芽孢杆菌活菌和灭活菌均能显著提高细胞内Na+K+-ATP酶活性及β-defensin、Hepcidin-1、NK-lysin和Piscidin-5基因的相对表达量（P<0.05）。芽孢杆菌培养上清液处理后细胞内Hepcidin-1和NK-lysin基因的相对表达量显著高于对照组（P<0.05）。以上结果表明:1×108 CFU/m L暹罗芽孢杆菌LF4诱导IECs 3 h时,IECs没有出现明显的损伤,且IECs内抗菌肽的表达量达到最大值;在本试验条件下,暹罗芽孢杆菌LF4活菌、灭活菌和菌培养上清液对花鲈IECs没有明显的损伤,都能诱导花鲈IECs内抗菌肽的表达,且灭活菌诱导效果优于活菌和菌培养上清液。3.芽孢杆菌诱导花鲈IECs内抗菌肽表达的信号通路初探用1×108 CFU/m L暹罗芽孢杆菌LF4活菌、灭活菌和菌培养上清液诱导花鲈IECs 3 h,测定细胞内TLRs、NLRs、MAPKs和NF-κB信号通路相关基因的表达水平。结果显示:暹罗芽孢杆菌LF4活菌、灭活菌和菌培养上清液均能显著上调细胞内TLR1、TLR2、TLR3、TLR5和NOD1、NOD2、My D88、IKKα、IKKβ、NF-κB基因的相对表达量（P<0.05）。暹罗芽孢杆菌LF4活菌和灭活菌组细胞内TIRAP、IRAK1、IRAK4、TRAF6、TAB1、ERK1/2、JNK、p38和AP-1基因的相对表达量显著高于对照组（P<0.05）,而菌培养上清液处理组与对照组相比不具有统计学意义（P>0.05）。各组细胞内IKBα1基因的相对表达量无显著差异（P>0.05）。综上,暹罗芽孢杆菌LF4活菌和灭活菌可能被Toll样受体和NOD样受体识别,通过My D88转导后激活下游NF-κB/MAPKs信号通路,从而诱导花鲈肠上皮细胞中抗菌肽的表达。