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107杨(Populus×euramericana’Neva’)和中林46杨(Populus×euramericanc ’zhonglin46’)是我国北方重要的速生欧美杨品种,2006年在我国河南省首次发现了欧美杨溃疡病,这也是世界上首次报道该病害。Lonsdalea quercina被鉴定为欧美杨溃疡病的病原菌。菌株N-5-1是分离自河南濮阳自然发病杨树枝条的致病菌株。为了阐明病原菌的致病机制,以及病原菌与寄主杨树之间相互作用的过程,为病害防治提供理论依据,本研究测定了N-5-1菌株的全基因组,通过序列分析找出可能与致病性有关的22个基因,分别进行插入突变和互补,用寄主杨树品种枝条进行生物测定,筛选出与病原菌致病性有关的基因,并且利用分子生物学方法对Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system, T3SS)、Ⅱ型分泌系统(type⊕secretion system, T2SS)基因簇结构及功能,以及Ⅲ型分泌系统效应子HrpW的结构和性质做了较深入的研究。研究得出以下主要结果：(1)全基因组序列分析表明菌株N-5-1染色体上存在一套完整的T3SS系统,该系统由27个基因组成,约23kb,其中9个为高度保守的结构hrc基因,其余18个基因是调控基因或者T3SS的效应子。将T3SS中结构基因hrcV缺失突变后,生物测定结果显示其致病力与野生菌株相比显著下降,而该基因互补菌株致病性能恢复到野生菌株水平。在烟草叶片上的接种实验表明,△hrcV丧失了诱导烟草过敏性坏死反应(HR)的能力。遗传学证据表明菌株N-5-1中的T3SS是重要的致病因子之一。但当N-5-1中T3SS结构被破坏后,与野生菌株相比,突变体菌株的生长速率、生物膜形成能力以及游动性并没有受到显著影响。(2) Hrpw是N-5-1中T3SS的一个效应子,其N-端具有Harpin结构域,而C-端则具有Pel结构域。同源性分析表明HrpW具有有果胶酸裂解酶第三家族(Pectate lyase class Ⅲ PL3)4个高度保守区域,通过HrpW蛋白质理化性质以及二级结构和三级结构的预测结果显示HrpW属于PL3家族。将hrpW突变后生物测定发现,突变体致病性与野生菌株相比有一定程度的下降,但在1%极显著水平,差异是不显著的。烟草叶片接种实验结果表明,除HrpW238-459外,其余处理均能引发烟草的HR反应,由此说明N-5-1中除HrpW外还存在其他的Harpin蛋白,同时也证明了HrpW1-237具有Harpin蛋白特性,而HrpW238-459则不具有诱发HR的能力。通过氨基酸序列分析发现,HrpW238-459中有2个保守的色氨酸(tryptophan, Trp)。对这2个Trp进行定点突变、原核表达(W104A、W171M蛋白)后,与HrpW、HrpW1-237、HrpW238-459在230nm波长下检测果胶酸裂解酶(pectate lyase, Pel)酶活,结果表明HrpW1-237、 W104A不能检测出Pel活性,而HrpW、HrpW238-459的Pel活性无显著差异,W171M的酶活比HrpW下降了68.3%,由此证明了这2个Trp是处于HrpW果胶酸裂解酶的活性位点,对HrpW的活性具有重要的作用。本研究还探索了钙离子和pH对HrpW果胶酸裂解酶活性的影响,当钙离子浓度大于0.1mM的条件下,HrpW的酶活保持在一个稳定的水平,而pH8.5-9.5是HrpW的最适pH。(3)根据全基因组序列分析,发现菌株N-5-1具有由12个基因编码的完整的Ⅱ型分泌系统(type Ⅱ secretion system, T2SS)结构,并且存在Sec和Tat2种蛋白转运途径。T2SS结构基因gspE缺失突变后,生物测定发现其缺失突变体致病性显著下降,且互补菌株的致病性能恢复到野生菌株水平,本实验从遗传学角度证明了T2SS与N-5-1的致病性有直接的关系。(4)通过全基因组序列分析,搜索到菌株N-5-1中共存在3个果胶酸裂解酶(pectate lyase, Pel),利用NCBI的Blast功能比对,结果显示N-5-1中的2个pel基因(pell. Pel2)与Dickeya dadantii3937中pelA、pelD、pelE具有很高的同源性,pel3与D.zeae Ech1591菌株中pel基因的同源性达78%,而D. dadantii3937中pelA. pelD、pelE基因编码的蛋白是通过T2SS外泌。将N-5-1中3个pel基因进行缺失突变,致病性检测发现,突变体菌株致病性与野生菌株并无显著差异。在230nm波长对T2SS结构基因突变体△gspE和pel基因突变体△pell、△pel2、△pel3以及相应的互补菌株进行Pel酶活测定,结果显示当T2SS结构基因突变后,Pel酶活显著下降,而pell、pel2、pel3分别突变后突变体的Pe1酶活与野生菌株保持一致,由此推测,N-5-1菌株胞外Pel活性蛋白大多是通过T2SS系统分泌,且N-5-1菌株中单个的pel基因对菌株整体的Pel酶活以及致病性并无显著影响。