目的与背景到目前为止,在哺乳动物中,KLFs(Krüppel-like factors)家族已经有十七个成员被鉴定出来,它们均属于DNA结合蛋白中的锌指结构家族,故具有转录活性。KLFs通过其锌指结构结合到DNA上的CACCC元件和GC丰富区域,发挥转录激活或转录抑制的生物学功能,并由此广泛参与细胞增殖、分化、发育、迁移、炎症、凋亡等生命活动过程。KLF4作为该家族中重要的一员,在细胞的生长、分化以及凋亡等生物学功能中具有十分重要的作用。SUMO(Small Ubiquitin-related Modifier Protein)化修饰是将SUMO小分子(SUMO1/2/3,人中有SUMO4,一种类泛素蛋白)共价结合到一系列底物蛋白上的一种翻译后修饰方式。SUMO化修饰是一个动态且可逆的过程,通过特异性的E1激活酶、E2结合酶、E3连接酶的特异性催化作用,将SUMO小分子共价结合在底物蛋白质特定的赖氨酸残基上,最终影响底物蛋白的生物学活性以及在细胞中的定位。而其可逆反应(去SUMO化修饰)则是由一类被称为SENPs(SUMO-specific proteases)的特异性蛋白酶来催化完成。巨噬细胞是机体天然免疫中的重要组成部分,并且在炎症反应以及机体免疫抵抗中发挥着十分重要的作用。由于单核-巨噬细胞系具有多样性以及可塑性等重要的特点,因此在组织中,单核-巨噬细胞可对不同的微环境会表现出不同的表型。根据组织微环境中的不同信号,巨噬细胞可以进行经典(M1)活化(Classically activated)(由TLR配体或者IFN-γ诱导)或者非经典(M2)活化(Alternativeactivated)(由IL-4或者IL-13诱导)。M1型巨噬细胞表现为促炎的效应,而M2型巨噬细胞则表现为抗炎的活性。2011年Liao等人的研究表明,KLF4在巨噬细胞向M2型极化的过程中发挥了重要的作用,但KLF4调控巨噬细胞极化的具体机制还有待深入。已有研究发现,KLF4是一种可以发生SUMO化修饰的蛋白。在本论文的研究中,我们将致力于揭示KLF4的SUMO化修饰在巨噬细胞向M2型极化过程中的重要作用。材料与方法1.所用细胞系、质粒和抗体细胞系:HEK-293T,HEK-293,RAW264.7,BMDM(Bone marrow derived macrophages),MEF(mouse embryonic fibroblast)细胞。质粒:p Shuttle-CMV,p Ad Easy-1,PXPAX2,PMD,PCDH-GFP vector;PCDNA3.1-vector,PCDNA3.1-HA-KLF4,PCDNA3.1-HA-KLF4-K278R,PCDNA3.1-FLAG-SUMO1,FLAG-SENP1,FLAG-SENP2,PCDNA3.1-GFP,RGS-SENP1、RGS-SENP1 mutant。抗体:FLAG M2和HA(Sigma公司)、RGS(Qiagen公司)、SUMO1(Abcam公司)、KLF4(Santa Cruz公司)、ACTIN(Cell Signaling Technology公司)。2.实验方法采用细胞培养、细胞转染技术、利用逆转录病毒构建KLF4稳转细胞系、利用腺病毒构建KLF4过表达细胞、小鼠骨髓来来巨噬细胞的获取和诱导、蛋白质印迹技术、蛋白质免疫共沉淀技术、RNA抽提技术、反转录实验技术、实时定量PCR、染色质免疫共沉淀实验技术、流式细胞术等。结果1)人来源的KLF4可以在K278位点发生SUMO化修饰;2)在RAW264.7细胞系中内源性KLF4可发生SUMO化修饰;3)SENP1与KLF4可以发生相互作用;4)SENP1介导KLF4发生去SUMO化修饰;5)在SENP1敲除的MEF细胞中KLF4的SUMO化修饰增强;6)IL-4可以增强KLF4的SUMO化修饰;7)在RAW264.7细胞中用IL-4刺激,KLF4的SUMO化修饰可以增强巨噬细胞M2型标志基因的表达;8)在IL-4的刺激下,KLF4的SUMO化修饰可以增加KLF4在Arg-1启动子区的结合;9)在BMDM细胞中用IL-4刺激,KLF4的SUMO化修饰可以增强M2型巨噬细胞标志基因的表达;10)在BMDM细胞中KLF4的SUMO化修饰促进细胞向M2型极化。结论1)KLF4可以发生SUMO化修饰,并且SENP1可以特异性的介导KLF4发生去SUMO化修饰;2)KLF4的SUMO化修饰可以应答IL-4的刺激,从而增加本身的SUMO化修饰;3)KLF4的SUMO化修饰可以促进IL-4诱导的巨噬细胞M2型标志基因的表达;4)KLF4的SUMO化修饰可以促进IL-4诱导的巨噬细胞向M2型极化。