【摘 要】
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Cystatin是一种能抑制木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶活性的半胱氨酸蛋白酶抑制剂,有4个亚家族,其中家族2具有抗原虫、抑制细胞凋亡等功能。在蜱类的生长发育过程中,唾液腺、卵
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Cystatin是一种能抑制木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶活性的半胱氨酸蛋白酶抑制剂,有4个亚家族,其中家族2具有抗原虫、抑制细胞凋亡等功能。在蜱类的生长发育过程中,唾液腺、卵巢等器官可分泌数种家族2,参与蜱吸血、血餐消化、胚胎发育等生理过程。本研究详细研究了褐黄血蜱Hfcyst-1、Hfcyst-2、Hfcyst-3和Hfcyst-4的基因、表达和功能。1.以RACE法扩增Contig3911、Contig8700、Contig7143、Contig8976的5’和3’端,得Hfcyst-1、Hfcyst-2、Hfcyst-3和Hfcyst-4的全长cDNA。Hfcyst-1全长738 bp,ORF大小429 bp,编码蛋白142aa;Hfcyst-2全长715 bp,ORF大小426 bp,编码蛋白141aa;Hfcyst-3全长722 bp,ORF大小426 bp,编码蛋白141aa;Hfcyst-4全长776 bp,ORF大小426 bp,编码蛋白141aa。结构分析表明,它们均属于Cystatin家族2。2.RT-PCR法测定Hfcyst-1、Hfcyst-2、Hfcyst-3和Hfcyst-4的表达水平,结果是:在不同发育阶段,幼蜱、若蜱、成蜱表达量依次增加;在不同饱血状态雌成蜱,除Hfcyst-2外,均在1/4饱血雌成蜱的表达量最高;在不同组织,饱血唾液腺和卵巢的表达量高于半饱血。3.将Hfcyst-3插入pET32a,阳性质粒转化BL21(DE3),经过IPTG诱导成功表达出重组蛋白(rHfcyst-3)。SDS-PAGE电泳显示,rHfcyst-3以不可溶性的包涵体形式表达,产物相对质量33kDa。测定表明,复性、纯化后的重组蛋白对Cathepsin S具有抑制作用。
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