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目的: 神经管畸形是一种严重的神经管缺陷性畸形，在世界范围内的发生率为0.5‰-20‰，目前还没有有效的治疗方式。近几年采用的脊柱裂修补术虽然能够减轻继发性脑积水和改善部分下肢功能，但是对修复下肢感觉障碍，运动障碍及自主神经功能障碍，例如膀胱、肛门等括约肌功能障碍导致的尿、便失禁等术后神经损伤的后遗症仍无良好效果，这是由于神经受损后的极难修复所造成的。因此，我们课题组提出在胚胎发育早期针对神经管畸形的神经发育不良而进行神经元的修复重建是提高手术治疗效果的关键，这样既可以治疗神经源性发育异常，又可以避免继发性损伤。 骨髓间充质干细胞是一种成体干细胞，具有自我增殖和分化为多种细胞的潜能，尤其是能够分化为神经细胞，移植后的MSCs表现出了较好的神经修复潜能，可在体外培养、扩增和诱导分化。 已有研究表明，肝细胞生长因子在MSCs治疗多发性硬化症、肝硬化、骨不连、肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤等疾病的治疗中起着重要作用，尤其是在多发性硬化症及肝纤维化的治疗中更为重要。 我们课题组在前期研究的基础上，利用骨髓MSCs羊膜腔内移植来治疗早期神经管畸形，证实了在神经管畸形早期，羊膜腔内注射的骨髓MSCs可以自主向胚胎神经管畸形缺损部位特异性迁移并存活，并且发现MSCs自主迁移可能与神经管畸形胚胎的体内微环境及趋化因子有关，本研究旨在探究骨髓MSCs移植后的迁移与Hgf/Met通路的关系，为探究细胞因子与骨髓MSCs迁移的关系提供研究基础和实验方法，为骨髓MSCs在神经管畸形胚胎中的早期治疗提供基础。 研究方法: 1、骨髓MSCs分离培养 选取适龄的Wistar大鼠，体重在60g到100g，在无菌条件下取出大鼠股骨，用5ml增殖培养基DMEM/F12(1∶1)(含10％胎牛血清)冲洗骨髓腔，适当吹打，做成细胞悬液，采用贴壁法分离骨髓MSCs，5％CO2，37℃孵箱中进行细胞培养。 绿色荧光蛋白标记骨髓MSCs，转染腺病毒-5F35-enhanced Gene FluorescentProtein(eGFP)，继续培养24h，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，细胞计数板计数GFP阳性细胞数及转染率，消化，吹打，离心后制成3000-5000个/ul的细胞悬液。 2、动物模型建立与羊膜腔内MSCs注射 成年Wistar大鼠雌雄比例5∶1午夜合笼，次日晨8:00左右进行阴道涂片，普通显微镜下发现精子即视为受孕，记为怀孕第0天(E0)，于孕鼠怀孕第9.5(E9.5)天或第10天(E10)时对孕鼠进行深度麻醉下剖腹取出子宫，在体式显微镜下分离胚胎，注意不要破坏卵黄囊膜和胎盘，进行体外培养，用DMSO溶解的全反式维甲酸致畸，随机将来自同一只孕鼠的胚胎分为正常对照组和3μM全反式维甲酸处理组，在不同O2浓度下旋转培养24h，弃掉DMSO溶解的全反式维甲酸，立即换上新鲜培养基。于48h后终止培养，取出胚胎，4％多聚甲醛固定。 在体外培养的不同时间点(E9.5，E10，E10+12h，E10+24h)进行羊膜腔内注射移植MSCs，使用显微注射针在胚胎背侧进入羊膜腔，注意避开卵黄囊血管发生部位，将0.2μl MSCs悬液或者单纯培养基注射到胚胎的羊膜腔内，注毕观察羊膜腔是否充盈，如果充盈则视为成功，继续于孵箱中培养至48h。 使用体式荧光显微镜观察骨髓MSCs的定植情况并且立即采集图像，分析骨髓MSCs的趋化规律。结束培养后的胚胎使用4％的多聚甲醛固定后进行冰冻切片，放于-80℃冰箱中保存。 3、组织切片、细胞计数与免疫荧光染色 冰冻切片:将胚胎从-80℃冰箱中取出，立即用OCT包埋，使用冰冻切片机取横断面连续切片，片厚20μm，在荧光显微镜下观察，选取有绿色荧光蛋白表达的玻片，-20℃保存备用。 细胞计数:将上述玻片于荧光显微镜下计数绿色荧光细胞个数。 免疫荧光染色:将上述冰冻切片经甲醇二次固定，抗原热修复，10％血清封闭，加一抗4℃过夜，加488或罗丹明标记的荧光二抗，DAPI染核。镜下观察。 4、荧光定量PCR检测不同时间点移植MSCs后Hgf/Met的表达情况 选取经体外培养48h的正常组和露脑畸形组胚胎，每组12例，提取胚胎中的总RNA，反转录成cDNA，应用合适的引物序列，配制反应体系，用ABI7500荧光定量PCR仪进行PCR反应，最后采用2-△△ct法分析目的基因mRNA相对表达量变化。检测正常组和露脑畸形组Hgf/Met的表达情况。 5、统计分析 数据以均数±标准差表示，采用Graphpad prism5软件对实验数据进行t检验和单因素方差分析，以P值表示统计差异，P＜0.05认为差异有统计学意义。 结果: 1、维甲酸体外诱导大鼠胚胎发生神经管畸形 利用浓度为3μM的全反式维甲酸对体外培养的大鼠胚胎进行诱导致畸，成功诱导胎鼠出现显性脊柱裂和露脑畸形等表型的神经管畸形。 2、不同时间点移植的MSCs在胎鼠中的定植率 胚胎羊膜腔内注射MSCs，在体外培养至48h后，利用荧光显微镜可以观察到骨髓MSCs在正常组胚胎和神经管畸形组胚胎中都有存活。其中，在正常组胚胎中，MSCs主要在闭合完全的中后脑背部神经管处存活，而在畸形胚胎中，MSCs主要定植部位在神经管畸形的发生部位和中后脑背部神经管。我们前期研究已经发现，MSCs在胚胎中的定植率随着畸形程度的加重而增多。在本研究中，我们观察了不同时间点注射移植对骨髓MSCs定植率的影响，结果表明，E9.5、E10在正常组和畸形组移植细胞的定植率较高，而E10+12h、E10+24h移植MSCs的定植率明显降低。 3、免疫荧光染色结果 细胞免疫荧光染色结果显示在MSCs染色中可以看出，体外培养的MSCs中高表达HGF，不表达MET。组织免疫荧光染色显示在胚胎中，脊髓部位高表达MET，而不表达HGF。 4、荧光定量PCR检测不同时间点移植MSCs后Hgf/Met的表达情况 定量PCR检测显示:与正常组相比，Hgf在E10时的mRNA表达水平在NTDs胚胎中升高6.636倍，(P＜0.01)，E10+12h时的表达量在NTDs胚胎中升高2.99倍(P＜0.01)，E10+24h时的表达量在NTDs胚胎中升高2.04倍(P＜0.01)，在E10+48h时Hgf在畸形胚胎中的表达无差异。 与正常组相比，畸形组Met在E10时的mRNA表达水平在NTDs胚胎中升高2.35倍，(P＜0.05)，E10+12h时的表达量在NTDs胚胎中升高1.63倍(P＜0.05)，在E10+24h，E10+48h时Met在畸形胚胎中的表达无差异。 结论: 神经管畸形发生不同时期进行羊膜腔注射MSCs，MSCs可向畸形部位自主迁移，并且越早进行移植，MSCs在胚胎畸形部位的定植率越高，HGF/MET信号通路在早期胚胎神经管畸形中的异常表达可能参与MSCs的自主迁移过程，为进一步探究NTDs的早期治疗新方法提供了研究基础。