研究背景子宫内膜容受性是人类生殖过程中一个不可或缺的重要因素。人类子宫内膜发生一系列形态上和功能上的改变,为胚胎种植提供最合适的子宫环境。在每个月经周期中,子宫内膜只在特定的时间内对胚胎呈接受状态,一般是在排卵后5-9天,这段短暂的时间被称为“种植窗口期”。目前有多种评价子宫内膜容受性的方法,例如经阴道超声检查、子宫内膜活检和免疫组化分析。然而,子宫内膜活检属于有创的入侵性检查方法,加上免疫组化操作复杂及价格昂贵,这些方法在临床上没有被推广应用。寻求无创、简便、经济的检查方法以评价子宫内膜容受性成为临床上最迫切的要求,因此,经阴道超声检查也许能成为理想的评价子宫内膜容受性的方法。由于血管生成、子宫内膜及内膜下区域的血管化和血流灌注在胚胎种植过程中起着重要作用,内膜周围的血流灌注能很好地反映子宫内膜容受性,许多学者开始研究子宫内膜及内膜下血流的定量测量。测量的方法有传统的彩色多普勒超声、频谱多普超声以及新近发展的三维能量多普勒超声成像(3D-PDA, three-dimensional power Doppler angiograpghy),它们均被尝试用于测量子宫内膜及内膜下血流。然而,这些研究的结果却不尽一致。因为子宫内膜的基底血管及螺旋血管是流速非常低的细小血管,加上不同的超声仪器对这些细小血管有着不同的敏感性,目前临床上仍未有获得一致认可的检测子宫内膜及内膜下血流灌注的方法与手段。随着可用于检测组织毛细血管网的第二代超声造影剂的面世,超声造影(CEUS,contrast-enhanced ultrasound)已被临床广泛应用于检测各种器官的血流灌注情况。由于超声造影剂的微泡直径远小于红细胞,CEUS联合造影剂可大大提高对组织微血管的检测率。在各种CEUS的重要参数中,峰值强度(Pi, peak intensity)和曲线下面积(AUC,area under curve)是超声造影增强强度的指标并用于评价血流灌注情况。因此,CEUS也许是检测子宫内膜微循环的种更好的方法。目前,已在学者利用CEUS检测短尾猴妊娠早期的子宫微循环血流灌注并以此作为预测宫内妊娠的工具。目前全世界大概有13%-17%育龄期夫妇患有不孕或不育,不明原因不孕约占其中15%-30%。有研究发现受损的子宫血流灌注也许是不明原因不孕的一个主要病因,并且子宫内膜及内膜下血流灌注也许是胚胎种植的关键因素。因此,本研究以不明原因不孕患者为研究人群,以此代表不良的子宫内膜容受性。第一章CDFI检测子宫内膜及内膜下血流灌注目的以微血管密度(MVD,microvessel density)为金标准,评价彩色多普勒超声检查(CDFI,color Doppler Flow Imaging)检测子宫内膜及内膜下血流灌注的临床价值。方法1研究对象30名不明原因不孕患者及30名健康育龄妇女被纳入本研究中。受试者均于2012年3月至12月就诊于南方医科大学第三附属医院妇产科门诊部。其中,18名不明原因不孕患者及15名健康育龄妇女接受了子宫内膜活检术,其余均拒绝这一检查。本研究获得南方医科大学第三附属医院伦理会批准,所有受试者均签署知情同意书。实验组的纳入标准：有正常、未避孕的性生活史1年仍未受孕,根据美国生殖医学临床委员会发布的不明原因不孕诊断标准指南被诊断为不明原因不孕的患者。对照组的纳入标准：过去一年内有正常生育史,无任何妇科不适主诉及妇科疾病的临床表现,并已停止母乳喂养3个月或以上的育龄妇女。除此之外,要求两组受试者的月经周期均为26-32日,受试前3个月内未服用任何可能影响盆腔供血的激素或非激素药物,没有凝血障碍及出血性疾病。所有受试者在受试期间进行性生活时需采取非药物性避孕。2超声检查与子宫内膜活检术的时间设定超声检查及子宫内膜活检设定在同一月经周期内的3个不同时期,分别为增殖晚期(D10-D12),排卵期(LH-LH+2)和种植窗口期(LH+8-LH+10)。每个时期内,超声检查安排在活检之前,超声检查包括经阴道彩色多普勒超声检查(CDFI,color Doppler Flow Imaging)及CEUS。所有的超声检查均在早上9点至12点进行。排卵日由阴道超声和尿促黄体生成素(LH,luteinizing hormone)浓度决定,具体如下：在进行完增殖晚期的超声检查和子宫内膜活检术后,叮嘱受试者使用尿LH试剂盒(上海凯创生物技术有限公司,中国)自行检测尿LH,一日两次(早上10点及晚上10点),直至LH峰日(试纸上显示T>C),自LH峰日起,受试者每日均接受经阴道超声检查,以明确排卵。只有当排卵发生在LH-LH+2日,试验才会继续进行至种植窗口期。3经阴道CDFI采用飞利浦IU22超声诊断仪(Philips,荷兰),C8-4v经阴道超声探头(5-7.5MHz)。先在灰阶上获取子宫的正中长轴切面,然后启动CDFI模式检测子宫内膜及内膜下血流,彩色取样框包括所有内膜及内膜下区域。取内膜边缘外5mm内的范围为内膜下区域。血流速度设定为2.1cm/,彩色增益设定为80%±2%,根据内膜及内膜下血流灌注情况分为以下3型：A型,血流信号在内膜区域可见并接近宫腔中线；B型,血流信号在内膜区域可见但不超过单层内膜的1/2；C型,血管信号在内膜下区域可见,但不进入内膜区域。4子宫内膜活检受试者喝水留尿保持膀胱充盈,采取膀胱截石位,常规消毒铺巾,采用立克灵一次性宫腔组织吸引管(上海佳宝医药公司,中国),平均进管深度7.8cm,管端抵达宫底后壁(或前壁)时往回抽吸,利用自身负压原理(≥150mmHg),带出少量子宫内膜组织。5免疫组化取出的内膜组织由石蜡包埋、切片并用鼠抗人单抗(QBEnd-10,基因,中国)进行CD34免疫组化染色。染色使用阳性对照(已知的卵巢癌切片)和阴性对照(PBS代替一抗孵育的组织切片)。CD34阳性反应物为浅棕至深棕色颗粒,分布在血管内皮细胞。子宫内膜组织中被染成棕色且与邻近微血管腺体组织分界清楚的单个细胞或细胞丛被视为一个新生血管,但需排除管腔内有8个以上红细胞、管腔较大或肌层较厚的血管。采用Weidne等的改良定量法对微血管密度(MVD,microvessel density)进行计数：先在100倍视野下寻找组织内微血管密集区,然后在200倍视野下计数5个不同视野的微血管,取其平均值作为该患者的MVD,用条／视野表示。6统计学分析使用SPSS13.0进行数据统计分析。计量资料以(炉s)表达。实验组与对照组间对比,计量资料使用独立样本t检验,计数资料使用Mann-Whitney U检验。两组各自在月经周期中3个不同时期间对比,计数资料使用Kruskal-Wallis检验。p<0.05视为有统计学差异。结果1一般资料30名不明原因不孕患者(23-32岁,平均年龄28.81±2.59岁)被纳入实验组,所有人均完成了超声检查,其中18人(23-32岁,平均年龄27.28±2.87岁)完成了内膜活检术。30名健康育龄妇女(20-31岁,平均年龄27.14±2.01岁)被纳入实验组,所有人均完成了超声检查,其中15人(21-31岁,平均年龄25.40±3.46岁)完成了内膜活检术。两组间完成超声检查及活检的受试者年龄比较均无显著性差异(p=0.075,p=0.098)2CDFI检测的子宫内膜及内膜下血流灌注分型2.1两组间的子宫内膜及内膜下血流灌注分型比较在增殖晚期,对照组与实验组的内膜及内膜下血流灌注类型有统计学差异(p=0.040),对照组的内膜及内膜下血流灌注比实验组丰富。在排卵期与种植窗口期,对照组与实验组的内膜及内膜下血流灌注类型比较无显著性差异(p=0.092,p=0.769)。2.2两组中子宫内膜及内膜下血流灌注分型3个不时期间的比较在实验组与对照组,内膜及内膜下血流灌注类型在月经周期中3个不同时期间比较均无显著性差异(p=0.092,p=0.769)。3子宫内膜MVD3.1两组间的MVD比较在增殖晚期,对照组的MVD显著高于实验组(p<0.001)； 在排卵期,对照组的MVD显著高于实验组(p<0.001)；在种植窗口期,两组间MVD比较无显著性差异(p=0.607)。3.2两组中MVD3个不时期间的比较在实验组与对照组,MVD在月经周期中3个不同时期间比较均有显著性差异(p<0.001,p<0.001)。其中两两比较,MVD在任意两时期间比较均有显著性差异。结论：1 MVD是血管生成最直接的反映,组织的微血管的数量越多,其血流灌注越丰富,是检测血管生成的定量指标。根据本研究的MVD结果发现,在增殖晚期及排卵期健康育龄妇女的内膜及内膜下的微血管比不明原因不孕妇女的更为丰富。从此可以推断,受损的内膜及内膜下血流灌注也许是不明原因不孕的病因之一。2根据CDFI的结果,我们发现两组间血流灌注情况比较,对照组只在增殖晚期比实验组显得更丰富,然而,MVD的结果则提示对照组的血流灌注情况在增殖晚期与排卵期均比实验组的血流灌注情况更为丰富。同时,在3个不同时期间比较,两组的内膜及内膜下血流灌注类型均无显著性差异,但两组的MVD均有显著性差异。CDFI与MVD的结果不一致。原因可能是：第一,CDFI对检测微血管有一定局限性。第二,尽管使用负压吸引管抽取内膜的损伤性不太,但活检所带来的微小损伤仍有可能刺激到微血管的增生,这可能导致排卵期两组间的内膜及内膜下血流灌注的差异减少,经阴道CDFI未能发现两组内膜及内膜下的血流灌注在排卯期的差异。因此,我们得出的结论是CDFI不能准确检测检测内膜及内膜下血流灌注情况。第二章CEUS检测子宫内膜及内膜下血流灌注目的以MVD为金标准,评价CEUS检测子宫内膜及内膜下血流灌注的临床价值。方法1研究对象参考第一章。2超声检查与子宫内膜活检术的时间设定参考第一章。3制备造影剂混悬液使用第二代超声造影剂Sonovue(Bracco,意大利)。使用前检查并保证声诺唯包装容器及瓶盖未破损。在使用前向小瓶内注入注射用生理盐水,即0.9%(w/v)无菌氯化钠注射液5mL,用力振摇瓶子20秒,直到冻干粉完全分散并得到均一的白色乳状液体。4CEUS采用飞利浦IU22超声诊断仪(Philips,荷兰),C8-4v经阴道超声探头(5-7.5MHz)及第二代超声造影剂Sonovueo首先获取子宫的正中长轴切面,以清楚显示整个子宫内膜及内膜下区域,选择进入自动超声造影模式(机械指数MI<0.06,反向脉冲谐波成像),整个造影过程在双幅成像介面中完成。用5ml0.9%的生理盐水作为溶液溶解造影剂并振荡20秒,于肘正中静脉团注入2.4ml造影剂混悬液,同时激活造影模式,保存动态图像至2分钟,形成DICOM格式用于日后的时间-强度曲线(TIC,time-intensity curve)的回顾分析。造影结束后用10ml 0.9%生理盐水冲管。所有的超声检查均由同一位有经验的超声科医生完成。5 TIC分析应用Q-Lab软件进行TIC分析。过程如下：(1)选择感兴趣区域(ROI)。为了减少操作者带来的差异,所有的ROI均由同一个人划取。在本研究中,我们在内膜区域选取了2个ROI,内膜下区域选取了6个ROI,并分别标记为子区域1-8。其中,内膜下区域定义为包围内膜边缘线外5mm范围。 (2)通过LDRW WIWO公式进行自动拟合,获得标准化后的TIC曲线(120秒),并自动获得所有ROI的Pi与AUC参数。 (3)计算子区域1-2、子区域3-8的Pi及AUC平均值用于统计分析。6子宫内膜活检参考第一章。7免疫组化参考第一章。6统计学分析使用SPSS13.0进行数据统计分析。计量资料以(x±s)表达。实验组与对照组间对比,计量资料使用独立样本t检验,计数资料使用Mann-Whitney U检验。两组各自在月经周期中3个不同时期间对比,计量资料使用方差分析,计数资料使用Kruskal-Wallis检验。子宫内膜及内膜下区域的CEUS参数和子宫内膜MVD之间的关系用spearman相关分析。p<0.05视为有统计学差异。结果1一般资料同第一章。2 CEUS检测子宫微循环灌注情况2.1两组间的TIC参数比较在增殖晚期,对照组的内膜Pi、内膜下Pi、内膜下AUC显著高于实验组(p<0.001,p<0.001,p=0.004)；在排卵期,对照组的内膜Pi、内膜AUC、内膜下Pi、内膜下AUC显著高于实验组(p<0.001,p=0.021,p<0.001,p=0.003);在种植窗口期,两组间的TIC参数比较无显著性差异。2.2两组中TIC参数3个不时期间的比较在实验组,内膜Pi、内膜AUC、内膜下AUC在月经周期中3个不同时期间比较均无显著性差异(p=0.134,p=0.096,p=0.059)。然而,内膜下Pi在这3个不周时期间比较有显著性差异(p<0.001),表现为从增殖晚期开始下降,至排卵期达最低值,于种植窗口期达峰值。其中两两比较,内膜下Pi在增殖晚期与排卵期间比较、排卵期与种植窗口期比较有显著性差异。在对照组,内膜Pi、内膜AUC、内膜下AUC在月经周期中3个不同时期间比较均无显著性差异(p=0.340,p=0.120,p=0.779)。然而,内膜下Pi在这3个不周时期间比较有显著性差异(p<0.001),表现为在增殖晚期达到峰值,至排卵期达最低值,然后上升至种植窗口期。其中两两比较,内膜下Pi在任意两时期间比较均有显著性差异。3子宫内膜MVD同第一章。4内膜下Pi与MVD的关系在实验组与对照组中,内膜下Pi与MVD均呈正相关关系(r=0.806,p<0.001；r=0.733,p<0.001)。结论：1回顾CEUS TIC参数的统计结果,在增殖晚期,对照组的内膜Pi、内膜下Pi、内膜下AUC显著高于实验组；在排卵期,对照组的内膜Pi、内膜AUC、内膜下Pi、内膜下AUC显著高于实验组。同时,在增殖晚期和排卵期,对照组的MVD均显著高于实验组。CEUS与MVD结果一致。这表明检测子宫内膜及内膜下血流灌注,CEUS比CDFI更具有优势。因此,我们可以利用CEUS检测子宫内膜及内膜下血流灌注以评价子宫内膜容受性。2两组中的内膜Pi、内膜AUC和内膜下AUC在月经周期中无显著性变化,只有内膜下Pi在月经周期中均显示出显著性变化,并且与MVD成正相关关系。本研究的Pi与MVD之间的正相关关系与这些肿瘤方面的研究结果是一致的,这意味着相比起内膜Pi、内膜AUC、内膜下AUC,内膜下Pi也许是检测子宫微循环灌注一个敏感的参数指标。3除了在种植窗口期,月经周期中实验组的内膜下Pi与内膜MVD均显著低于对照组。我们猜想,不明原因不孕患者与健康育龄妇女之间的差异早在种植窗口期之前出现。在种植窗口期前的子宫内膜血流供应不足也许是不明原因不孕的一个致病因素。4本研究为我们提供了在月经周期中正常与非正常子宫内膜微循环变化情况的特点。在对照组中,内膜下Pi在增殖晚期达到峰值,至排卵期达最低值,然后再次下降至种植窗口期。然而,在实验组中,内膜下Pi峰值出现在种植窗口期,而并没有出现在增殖晚期。因此,我们推测子宫内膜在增殖晚期内没有为日后内膜生长准备充足的血流灌注,这可能导致内膜发育不良及不孕。