研究目的对于伴有功能错颌畸形的儿童或青少年,采用功能矫正器改变其骨骼位置关系,协调上下颌骨的生长,是获得理想矫正效果的一种重要治疗的手段。功能矫形能够促进或者抑制颌面部骨骼的生长,引导颌面部向美观协调的方向生长,可以降低后期矫正难度或减少正颌外科手术的必要性。安氏Ⅱ类错(?)奇形是临床上最常见的错(?)畸形类型,其发病率为15%-20%,占正畸患者的49%。Ⅱ类错(?)矢状向关系上的主要表现为下颌的后缩,这一类的病人约占骨性Ⅱ类错(?)的50%-60%。安氏Ⅱ类错颌不仅影响患者功能,如咀嚼、发音、呼吸、通气功能等,还能影响患者的外观,影响患者的心理。安氏Ⅱ类错颌的治疗难度大,治疗效果受到患者生长发育的影响,是正畸治疗中的难点。在成人阶段,治疗严重的骨性Ⅱ类错合畸形的手段多为正颌外科,通过牵张成骨或下颌体部截骨前移下颌。正颌外科存在风险大,费用高,患者接受度低等制约条件,如果在患者青春期前或患者发育早期采用功能矫形促进下颌的生长,使下颌达到正常的生长,协调上下颌骨之间的关系,通过这种治疗手段纠正Ⅱ类错合患者,减少后期治疗难度,减少正颌手术的必要性,因此早期的功能矫正已经成为矫正安氏Ⅱ类错牙合畸形常采取的方法。功能矫形中下颌前移的过程常受到颞下颌关节髁突与关节窝的限制,而髁突作为下颌主要的生长中心,能够在外力下作出适应性改建,对于下颌骨的生长起到决定作用。因此髁突的生长改建的研究对于安氏Ⅱ类错颌的治疗具有重要的理论和临床意义。髁突表面覆盖的软骨为纤维性软骨,属于继发性软骨,继发性软骨与原发性软骨具有许多不同的特点,其中继发性软骨的生长控制因素既包括遗传因素还受到环境与功能因素的影响,同时继发性软骨在受到外力的作用下不仅能产生生长方向的改变还会发生生长量的变化。髁突软骨作为继发性软骨通过软骨内成骨的形式不断形成新骨,终生具有生长改建能力,其生长潜力及在受到刺激后的生长能力在很大程度上影响着下颌骨在三维方向上的生长,尤其是在矢状方向和垂直方向上的生长。髁突软骨由软骨细胞与细胞基质组成,细胞成分较少,在适当的力作用下髁突软骨细胞可以活跃,分裂增殖,使髁突发生适应性改建。髁突软骨的生长发育改建是一个非常复杂的过程,研究表明髁突软骨的生长涉及到多个方面,包括软骨细胞的增殖、分化、凋亡,胞外基质的合成、修复等过程,研究证明髁突软骨在生长改建过程中受到多种生长因子的相互协调控制,通过对这些生长因子的研究可以探讨髁突软骨的生长改建机理,对临床起指导作用。现在的生物力学认为在功能矫形安氏Ⅱ类错(?)畸形过程,通过矫正器持续的对下颌施加前伸力,颞下颌关节韧带对髁突软骨牵张加力,改变髁突软骨细胞的受力环境,进而通过一系列细胞因子的调节,促进软骨区细胞分化、增生、改建,进而形成新的骨组织,促进下颌升枝在矢状方向和垂直方向上的生长改变。但具体的生长因子作用途径,相互作用机理还处于前期探讨阶段。前期研究表明由定向前肥大软骨细胞分泌、Hedgehog家族成员之一Ihh是软骨细胞内最为活跃的反应性因子。在对于体内长骨等研究表明在软骨分化成骨,细胞增殖过程中软骨内的lhh表达可增加。Ihh对软骨细胞的调控机制主要是通过Ihh-PTHrP信号轴通路起作用的,Ihh通过一系列的信号传导,促进关节软骨细胞分泌甲状旁腺样蛋白(PTHrP),通过与非定向前肥大软骨细胞PTHrP受体结合而延迟其分化并保持其增殖状态。在对体内四肢关节软骨的研究证实Ihh在软骨细胞增殖以及软骨细胞向肥大软骨细胞分化的过程中发挥重要的调控作用,但在人体终生具有的改建能力的颞下颌关节髁突软骨的研究却未见报道,因此明确Ihh在颞下颌髁突软骨细胞增殖中的调控机制对于骨性Ⅱ类错颌畸形的矫正具有重要的理论和临床意义。本实验拟在构建兔髁突软骨细胞体外培养力学刺激模型的基础上,应用应力加载系统,对髁突软骨细胞施以周期性张应力,研究兔髁突软骨细胞在不同应力刺激时间下Ihh、PTHrP信号的表达及Ihh-PTHrP信号轴通路在髁突软骨细胞增殖中的作用及机制。研究方法选2周龄新西兰白兔,取其髁突软骨,机械粉碎后采用两步酶原消化法进行消化,获得具有生物活性的髁突软骨细胞。对髁突软骨细胞的培养,鉴定,冻存复苏。应用多通道应力加载装置对分别对兔髁突软骨细胞加载1h、2h、6h、12h和24h的周期性张应力(频率为6 cycles/min,拉伸变形率为10%),观察细胞生长变化,构建兔髁突软骨细胞-体外培养力学刺激模型。将细胞分组,分为加力组与对照组,应用流式细胞仪及MTT方法检测周期性张应力加力时间不同对各组髁突软骨细胞增殖变化的影响。采用R-TPCR技术和Western blotting分析检测周期性张应力加力时间不同对各组髁突软骨细胞Ihh,、PTHrP mRNA和蛋白的表达变化。在施加周期性张应力的细胞组中加入Ihh特异性抑制剂环王巴明(Cyclopamine)与未加抑制剂组细胞对比,采用MTT方法检测周期性张应力加力时间不同对各组髁突软骨细胞增殖变化的影响。采用R-T PCR技术和 Western blotting分析检测周期性张应力加力时间不同对各组髁突软骨细胞Ihh,、PTHrP mRNA和蛋白的表达变化。实验结果采用SPSS 17.0对实验数据进行分析。结果1、成功体外培养了髁突软骨细胞,构建髁突软骨细胞-体外培养力学刺激模型。2、在加力组与对照组细胞增殖的结果分析,MTT法检测加力组髁突软骨细胞数量增加,在6h、12h、24h结果具有显著的统计学差异(p<0.01)；流式细胞技术结果表明,加力组S期细胞比例高于对照组,在6h结果有统计学差异(p<0.05),在12h、24h有显著的统计学差异(p<0.01)；细胞增殖指数加力组高于对照组,在6h结果有统计学差异(p<0.05),在12h、24h具有显著统计学差异(p<0.01)。3、加力组与对照组Ihh RT-PCR及Weston-Blot结果分析：加力组细胞受到张应力刺激后Ihh RT-PCR检测结果随时间增加而增加,相同时间点结果均高于对照组,6h检测结果具有统计学差异,12h、24h统计结果具有显著统计学差异。4、加力组与对照组PTHrP RT-PCR western blot结果分析,加力组细胞受到张应力刺激后PTHrP RT-PCR检测结果随时间增加而增加,相同时间点结果均高于对照组,6h检测结果具有统计学差异,12h、 24h统计结果具有显著统计学差异。5、加入Ihh特异性抑制剂环王巴明后,施加周期性张应力的髁突软骨细胞增殖活性两组之间MTT结果比较,抑制组(加抑制剂组)低于加力组(未加抑制剂组),两组之间具有统计学差异(p<0.05)。6、加入Ihh特异性抑制剂环王巴明后,Real Time PCR检测Ihh mRNA及Western blotting检测Ihh蛋白表达量结果分析,抑制组(加抑制剂组)在1h、2h时间段低于加力组(未加抑制剂组),在12h、24h实验结果高于对照组,两组之间差异无统计学意义。7、加入Ihh特异性抑制剂环王巴明后,施加周期性张应力,Real Time PCR检测PTHrP mRNA及Western blotting检测PTHrP蛋白表达结果显示,抑制组(加抑制剂组)结果低于加力组(未加抑制剂组),24h抑制组(加抑制剂组)与加力组(未加抑制剂组)相比两组数据具有统计学差异(p<0.05)。8、对照组与抑制组细胞增殖MTT方法检测结果分析,抑制组虽然使用了Ihh特异性抑制剂,但是加力对细胞增殖还是有一定的影响,抑制组细胞增殖高于对照组。在24h时表现有明显的统计学差异。9、对照组与抑制组细胞PTHrP RT-PCR及western blot结果分析,抑制组虽然使用了Ihh特异性抑制剂,但加载应力的细胞PTHrP表达仍高于对照组,在24h时表现有明显的统计学差异。结论1、周期性张应力可以促进髁突软骨细胞增殖,同时也能够促进Ihh以及PTHrP的mRNA以及蛋白的表达,呈一致上升趋势,说明Ihh-PTHrP信号传导通路参与了应力介导的髁突软骨细胞增殖。2、加入抑制剂阻断Ihh的作用后髁突软骨细胞增殖活性下降,提示应力作用下髁突软骨细胞增殖受到Ihh-PTHrP信号传导通路的调控；加入抑制剂后,阻断Ihh的作用后随细胞增殖活性下降,PTHrP的表达下降,说明Ihh通过一定的信号因子传导对PTHrP起调控作用,通过对PTHrP的影响调节软骨细胞增殖过程；加入抑制剂后,Ihh表达实验组与加力组之间没有统计学差异,说明抑制剂对应力作用下Ihh的上调机制没有影响3、在阻断Ihh的作用后髁突软骨细胞的增殖活性下降但仍高于对照组,说明抑制剂不能完全抑制应力对细胞增殖的影响,说明应力与细胞增殖活动之间存在多种信号途径。4、PTHrP的表达在加力加抑制剂组高于未加力组,Ihh抑制剂不能完全抑制应力作用下细胞PTHrP的表达,说明还有Ihh之外的PTHrP上调途径。