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间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于早期中胚层，具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。利用其多向分化潜能和免疫调控特性可有效治疗包括骨组织损伤、移植物抗宿主病、神经系统疾病和肝脏系统疾病等多种疾病，其中与脂肪细胞的发育和功能异常相关疾病如糖尿病、肥胖等成为近年研究的热点。
野生型P53诱导的磷酸酶1(Wild type p53-induced phospatase1，Wip1)是由PPM1D基因编码的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，在细胞稳态调控、DNA损伤修复、肿瘤发生、抗细胞衰老及免疫调控等方面发挥重要作用。有研究发现，Wip1可抑制MSCs的增殖进而增强MSCs的迁移能力。但目前基本尚无Wip1基因对MSCs成脂分化的作用与机制研究。为此，本研究利用Wip1基因敲除小鼠，探究Wip1基因调控小鼠骨实质来源MSCs向脂肪细胞分化的作用与机制。
我们首先分离培养Wip1基因敲除小鼠骨实质来源的MSCs，通过倒置显微镜观察细胞形态、流式细胞术检测细胞表型和体外诱导分化鉴定MSCs。其次，利用油红O染色和实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术，比较WT-MSCs和Wip1-/-MSCs成脂分化能力的差异。第三，利用实验室前期基因芯片结果，结合生物信息学分析，获得Wip1调控MSCs成脂分化的靶基因蛋白磷酸酶2A(PP2A)，利用Western blot检测脂肪细胞分化的关键蛋白PP2A在WT-MSCs和Wip1-/-MSCs中表达差异。进一步，构建过表达Wip1的EGFP-Wip1质粒，转染至293T细胞中，Western blot检测过表达Wip1后PP2A的表达变化。而后，分别收集MSCs成脂诱导分化的第0天、第2天、第4天和第5天的样本，RT-PCR检测MSCs成脂分化过程中，成脂关键转录因子PPARγ与PP2A的表达相关性。最后合成siRNA-PP2A瞬时转染MSCs，检测PP2A敲低对PPARγ表达水平影响。
研究结果表明，分离获得的WT-MSCs和Wip1-/-MSCs细胞均呈纤维样、贴壁生长，细胞表型为CD29+CD90+CD105+Sca-1+CD11b-CD34-CD45-MHCⅡ-，体外诱导可向脂肪细胞和骨细胞分化，上述结果符合MSCs判定标准。
进一步，比较WT-MSCs和Wip1-/-MSCs的差异性，结果显示，两种细胞在形态和细胞免疫表型上均无显著差异，但成脂分化能力差异显著。油红O染色检测成脂分化后脂滴数，Wip1-/-MSCs诱导组显著低于WT-MSCs诱导组（P＜0.001）。RT-PCR检测Wip1-/-MSCs成脂分化关键转录因子PPARγ和C/EBPa的表达也显著低于WT-MSCs（P＜0.001）。
为探讨Wip1调控MSCs成脂分化能力的作用机制，我们利用前期基因芯片结果结合生物信息学分析，筛选获得WT-MSCs和Wip1-/-MSCs差异靶基因PP2A。利用Western blot验证。结果表明，PP2A在Wip1-/-MSCs中表达显著降低。进一步构建过表达EGFP-Wip1瞬时表达载体，转染293T细胞，Western blot检测在293T细胞中过表达EGFP-Wip1可使PP2A蛋白表达显著上升；而后，为探讨PP2A与MSCs成脂分化关键转录因子PPARγ是否存在相关性，我们检测了小鼠MSCs成脂分化第0天、第2天、第4天和第5天PP2A与PPARγ的表达。结果表明，随着成脂诱导分化时间的增加，脂滴数逐渐增多。RT-PCR检测MSCs成脂诱导过程中PP2A的表达与成脂关键转录因子PPARγ的表达改变一致，提示PP2A与成脂关键转录因子PPARγ存在相关性。为进一步探究Wip1是否通过PP2A调控MSCs的成脂分化，我们用siRNA-PP2A瞬时转染MSCs，48h后采用RT-PCR检测MSCs中PPARγ的表达。结果显示，敲低PP2A可使MSCs中成脂关键转录因子PPARγ表达显著降低（p＜0.001），提示Wip1通过PP2A调控PPARγ表达，进而影响MSCs的成脂分化功能。
上述实验结果说明，Wip1通过调控PP2A的表达影响MSCs的成脂分化，为深入探讨MSCs成脂分化机制提供了理论与实验依据。
野生型P53诱导的磷酸酶1(Wild type p53-induced phospatase1，Wip1)是由PPM1D基因编码的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，在细胞稳态调控、DNA损伤修复、肿瘤发生、抗细胞衰老及免疫调控等方面发挥重要作用。有研究发现，Wip1可抑制MSCs的增殖进而增强MSCs的迁移能力。但目前基本尚无Wip1基因对MSCs成脂分化的作用与机制研究。为此，本研究利用Wip1基因敲除小鼠，探究Wip1基因调控小鼠骨实质来源MSCs向脂肪细胞分化的作用与机制。
我们首先分离培养Wip1基因敲除小鼠骨实质来源的MSCs，通过倒置显微镜观察细胞形态、流式细胞术检测细胞表型和体外诱导分化鉴定MSCs。其次，利用油红O染色和实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术，比较WT-MSCs和Wip1-/-MSCs成脂分化能力的差异。第三，利用实验室前期基因芯片结果，结合生物信息学分析，获得Wip1调控MSCs成脂分化的靶基因蛋白磷酸酶2A(PP2A)，利用Western blot检测脂肪细胞分化的关键蛋白PP2A在WT-MSCs和Wip1-/-MSCs中表达差异。进一步，构建过表达Wip1的EGFP-Wip1质粒，转染至293T细胞中，Western blot检测过表达Wip1后PP2A的表达变化。而后，分别收集MSCs成脂诱导分化的第0天、第2天、第4天和第5天的样本，RT-PCR检测MSCs成脂分化过程中，成脂关键转录因子PPARγ与PP2A的表达相关性。最后合成siRNA-PP2A瞬时转染MSCs，检测PP2A敲低对PPARγ表达水平影响。
研究结果表明，分离获得的WT-MSCs和Wip1-/-MSCs细胞均呈纤维样、贴壁生长，细胞表型为CD29+CD90+CD105+Sca-1+CD11b-CD34-CD45-MHCⅡ-，体外诱导可向脂肪细胞和骨细胞分化，上述结果符合MSCs判定标准。
进一步，比较WT-MSCs和Wip1-/-MSCs的差异性，结果显示，两种细胞在形态和细胞免疫表型上均无显著差异，但成脂分化能力差异显著。油红O染色检测成脂分化后脂滴数，Wip1-/-MSCs诱导组显著低于WT-MSCs诱导组（P＜0.001）。RT-PCR检测Wip1-/-MSCs成脂分化关键转录因子PPARγ和C/EBPa的表达也显著低于WT-MSCs（P＜0.001）。
为探讨Wip1调控MSCs成脂分化能力的作用机制，我们利用前期基因芯片结果结合生物信息学分析，筛选获得WT-MSCs和Wip1-/-MSCs差异靶基因PP2A。利用Western blot验证。结果表明，PP2A在Wip1-/-MSCs中表达显著降低。进一步构建过表达EGFP-Wip1瞬时表达载体，转染293T细胞，Western blot检测在293T细胞中过表达EGFP-Wip1可使PP2A蛋白表达显著上升；而后，为探讨PP2A与MSCs成脂分化关键转录因子PPARγ是否存在相关性，我们检测了小鼠MSCs成脂分化第0天、第2天、第4天和第5天PP2A与PPARγ的表达。结果表明，随着成脂诱导分化时间的增加，脂滴数逐渐增多。RT-PCR检测MSCs成脂诱导过程中PP2A的表达与成脂关键转录因子PPARγ的表达改变一致，提示PP2A与成脂关键转录因子PPARγ存在相关性。为进一步探究Wip1是否通过PP2A调控MSCs的成脂分化，我们用siRNA-PP2A瞬时转染MSCs，48h后采用RT-PCR检测MSCs中PPARγ的表达。结果显示，敲低PP2A可使MSCs中成脂关键转录因子PPARγ表达显著降低（p＜0.001），提示Wip1通过PP2A调控PPARγ表达，进而影响MSCs的成脂分化功能。
上述实验结果说明，Wip1通过调控PP2A的表达影响MSCs的成脂分化，为深入探讨MSCs成脂分化机制提供了理论与实验依据。