虾青素是一种高附加值的类胡萝卜素,不仅可以作为饲料添加剂应用到特种水产养殖,而且还可以作为天然抗氧化剂和自由基清除剂用于保健食品、高档化妆品。此外,动物试验证明虾青素在增强免疫和抗癌变等方面起到重要作用。红发夫酵母具有生长周期短、占地面积小、易实现高密度培养等优势,因而成为近年来生产天然色素和高附加值产品虾青素的研究对象。目前,利用红发夫酵母生产虾青素还面临着菌体密度较低和虾青素含量偏低等诸多问题,有必要进一步优化培养条件和探索红发夫酵母胞内虾青素的合成机制,期望提高红法夫酵母发酵生产虾青素的含量和产量。本文以实验室保藏的红法夫酵母(X.dendrorhous UV3-721)作为研究菌株,从较少有人开展的无机氮源对红法夫酵母合成虾青素的影响出发,选取不同铵盐和硝酸盐研究其对红法夫酵母的细胞生长和虾青素积累的影响,通过研究铵态氮对红法夫酵母虾青素合成途径中编码关键酶的基因转录水平以及胞内小分子代谢物相对丰度的变化情况,阐明铵态氮对虾青素合成的调控机制。同时,本文还研究了与TCA循环相关的四种短链羧酸对红发夫酵母菌体生长及虾青素合成的影响。在此基础上研究通过添加铵态氮和短链羧酸提高虾青素产量的发酵放大技术,找到利用红法夫酵母发酵生产虾青素的廉价氮源,具体结果如下:一、考察了添加不同无机氮源对红发夫酵母细胞生长和虾青素合成的影响。结果表明铵态氮的添加能够提高菌体合成虾青素能力。随后考察了硫酸铵的添加时间和添加浓度对红法夫酵母产虾青素的影响,确定了硫酸铵的最优添加时间为培养初期,添加浓度为1 g/L,在此培养条件下菌体的虾青素含量达到9.06 mg/g,比对照提高了64.4%。二、考察添加硫酸铵对虾青素生物合成途径中六个关键基因转录水平表达的影响,结果表明虾青素合成途径中上游基因ipi、crtE在菌体停滞期和对数生长期(0～72 h)显示较高的相对表达量,可能与菌体在准备上游路径的相关前体物质及其它类胡萝卜素合成有关;下游基因crtYB、crtS和crtR在菌体生长稳定期后(72～144 h)的相对表达量较高,表明前期积累的上游前体物质和其它类胡萝卜素在后期有效的流向了终端产物虾青素的合成。三、研究了红发夫酵母胞内小分子代谢物相对丰度的变化,其中发生明显变化的是硫酸铵实验组的脂肪酸代谢显著削弱,这会导致乙酰辅酶A更多的流入类胡萝卜素合成途径上游的甲羟戊酸合成,从而促进虾青素等类胡萝卜素的积累;并且菌体胞内酸性物质积累致使内环境呈现酸性,这也同样有利于菌体积累虾青素。四、研究了四种与TCA循环相关的短链羧酸(乙酸、丙酮酸、琥珀酸和苹果酸)对红发夫酵母菌体生长及虾青素合成的影响。结果表明在24h添加30 mM的乙酸钠可以明显提高菌体生物量,菌体生物量达到了4.66g/L,比对照组提高了38.2%;24 h添加40 mM的丙酮酸一定程度促进菌体生长和虾青素积累。复合添加丙酮酸和硫酸铵的策略在一定程度上缓解了硫酸铵对菌体的生长抑制作用,虾青素产量和含量分别达到33.24 mg/L和8.20 mg/g,比对照组分别提高了33.3%和36.4%。五、考察了在5L发酵罐中通过复合添加丙酮酸和硫酸铵提高虾青素产量的发酵放大技术,结果表明与对照组相比生物量和虾青素含量显著提高。经6d发酵,最大生物量可达13.40 g/L,总类胡萝卜素和虾青素产量分别为270.96 mg/L和99.66 mg/L,虾青素含量为7.65 mg/g,分别比对照组提高了 40%、83.7%和54.5%。