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脱氧核苷酸在临床上主要用于医治白血球细胞减少症,对再生障碍性贫血、血小板减少、肝炎等病症也有较好的疗效。广泛应用的生物工程试剂脱氧核苷三磷酸是脱氧核苷酸通过酶催化磷酸化得到的,由脱氧核苷酸酶水解脱氧核苷酸得到的2′一脱氧核苷是合成脱氧核苷类药物的重要原料。核酸酶P1（EC3.1.30.1）是一种含锌金属酶,由桔青霉（Penicillium citrinum）发酵制得,可以水解RNA和热变性DNA的磷酸二酯键而得到5′-核苷酸和5′-脱氧核苷酸。用核酸酶P1催化水解热变性DNA制取脱氧核苷酸是制备这类药物的有效方法之一。 国内对用酶水解热变性DNA制备5′-脱氧核苷酸的研究报道自70年代开始。但迄今为止,国内对热变性DNA的水解或脱氧核苷酸的应用基础研究的报道也只有寥寥几篇,而且对脱氧核苷酸还没有实现规模化制备。因此本文研究离子注入对产核酸酶P1的桔青霉菌株的改良作用,提高核酸酶的活力,从而进一步提高水解得率,降低副产物的产生,从而降低生产成本。同时研究核酸酶P1对热变性的DNA的酶解过程并优化其工艺条件,为以后的脱氧核苷酸的工业开发应用工作做准备。 本课题的研究的主要内容为两部分,分别为桔青霉菌株的离子注入诱变筛选及其摇瓶发酵研究和热变性的单链DNA的水解研究。 本论文中,通过考察出发菌株发酵产酶的酶活,确定GCY01菌株作为用于诱变筛选的出发菌株。对其采用氮离子注入诱变,确定最佳注入能量为10Kev,最佳注入剂量为20×1014N+·cm-2,筛选出5株正突变株,发酵产酶的酶活最高提高了61%,通过突变菌株遗传稳定性考察,将其命名为Z-040727-2。诱变后高产菌株发酵的液体种子生长的指数期为10～32h;其液体摇瓶发酵24h时,酶活力可以达到最大值,为290u。 通过对发酵条件进行优化,得到了较好的发酵条件为,接种量为10%,种龄为24h;初始发酵pH为6.50;发酵温度对产酶影响比较大,较低温度有利于菌体产酶,但是其发酵周期则会相应地延长。 核酸酶P1催化水解热变性DNA,首先对水解的过程曲线进行了初步研究,发现水解时dGMP的生成速度最快,dCMP的速度最慢,脱氧核苷酸总量在水解