目的观察小鼠CD4⁺T细胞来源外泌体（exosomes）对乙型肝炎表面抗原（HBsAg）疫苗接种小鼠体内抗体产生及B细胞变化的影响,并探讨CD4⁺T细胞来源exosomes对B细胞功能的促进作用及其机制。方法（1）于6-8w雌性Babl/c小鼠左后肢大腿肌肉注射100μL浓度为20μg/m L HBsAg疫苗,14天后于右后肢大腿肌肉等剂量加强一次,建立HBs Ag疫苗接种小鼠模型。免疫磁珠法分离HBsAg疫苗接种小鼠和野生型小鼠脾脏来源CD4⁺T细胞,经2μg/m L抗小鼠CD3、CD28抗体体外活化24h,通过联合超速离心、膜超滤以及沉淀法提取活化CD4⁺T细胞培养上清中exosomes,分别制备HBsAg疫苗接种小鼠的CD4⁺T细胞exosomes（HB-T-Exo）和野生型小鼠的CD4⁺T细胞exosomes（WT-T-Exo）。透射电子显微镜观察exosomes形态,纳米颗粒跟踪分析仪检测exosomes粒径分布,流式细胞仪检测exosomes表面分子,蛋白质印迹法（Western blot,WB）检测exosomes相关蛋白的表达。（2）在第0天和第14天,分别于小鼠后肢大腿肌肉注射100μL浓度为20μg/mL HBsAg疫苗,同时尾静脉注射50μg HB-T-Exo,WT-T-Exo作为exosomes对照,PBS作为空白对照。分别于第16天、23天、30天、40天、50天断尾取血,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中乙型肝炎表面抗体（HBsAb）及其亚型的含量。第50天脱颈处死小鼠,流式细胞仪检测脾脏Th1细胞、Th2细胞、B细胞、浆细胞,以及骨髓中浆细胞的比例。（3）将PKH26标记CD4⁺T细胞exosomes,取30μg标记的exosomes与小鼠脾脏淋巴细胞共培养4h,流式细胞仪检测T、B细胞与exosomes结合的情况。将PKH67标记的CD4⁺T细胞exosomes与磁珠分离的B细胞共培养4h后,激光共聚焦显微镜观察B细胞内化exosomes的情况。（4）制备鸡卵清白蛋白（OVA）免疫小鼠和野生型小鼠来源的CD4⁺T细胞exosomes（OVA-T-Exo和WT-T-Exo）,将其与OVA免疫小鼠来源的B细胞共培养,流式细胞仪检测B细胞表面分子CD86、CD80、CD40以及MHCⅡ的表达,CFSE染色法检测B细胞的增殖能力,ELISA检测共培养上清中抗体的含量。（5）利用CD40L ShRNA质粒转染小鼠T细胞淋巴瘤EL-4细胞,建立CD40L敲减细胞系,制备CD40L敲减EL-4细胞来源的exosomes,进而探讨CD40L分子在T细胞来源exosomes介导的B细胞反应中的作用。结果（1）CD4⁺T细胞exosomes在电镜下呈圆形或椭圆形圆盘状结构,粒径主要分布在50-150nm左右,表面表达CD4、CD25以及ICOS等分子,WB检测发现其表达CD63、CD9以及Hsp70等exosomes特征性蛋白,同时也表达CD40L分子。（2）经不同来源CD4⁺T细胞exosomes处理后,我们发现,与PBS对照组和WT-T-Exo处理组相比,HB-T-Exo处理后的HBsAg疫苗接种小鼠血清中HBsAb抗体水平显著升高。在第50天时,HB-T-Exo处理组小鼠血清中HBsAb抗体水平显著高于WT-T-Exo处理组和PBS对照组小鼠（P<0.05）,而WT-T-Exo处理组小鼠血清中HBs Ab抗体水平与PBS对照组相比,两者无明显差异,表明CD4⁺T细胞exosomes体内发挥作用具有抗原特异性。通过对HBsAb抗体亚型检测,我们发现,HB-T-Exo处理组小鼠血清中IgG2a亚型明显增加,而IgG1亚型变化则不明显,表明CD4⁺T细胞exosomes介导的体液免疫应答的增强作用主要是促进了Th1型抗体的生成。在PBS对照组小鼠中,骨髓浆细胞的比例为3.14±0.98%,而HB-T-Exo和WT-T-Exo处理组小鼠骨髓浆细胞的比例分别为17.83±2.23%（P<0.01）和17.07±3.40%（P<0.05）,表明不同来源CD4⁺T细胞exosomes均能够促进HBsAg疫苗接种小鼠浆细胞的产生。此外,在PBS对照组小鼠中,Th1细胞的比例为2.50±0.33%,而HB-T-Exo和WT-T-Exo处理组小鼠分别为4.38±0.32%和3.62±0.36%,Th1细胞比例显著升高,但不同来源CD4⁺T细胞exosomes对小鼠脾脏Th2细胞、B细胞以及浆细胞的比例无显著影响。（3）通过流式细胞仪检测脾脏T、B细胞对exosomes的结合效率,我们发现,PKH26标记的CD4⁺T细胞exosomes能够更多地与B细胞结合,PKH26在B细胞上的平均荧光强度（MFI）大约是T细胞的3.5倍（P<0.01）。激光共聚焦显微镜观察进一步表明了CD4⁺T细胞exosomes能够被B细胞结合并内化。（4）体外实验显示,活化CD4⁺T细胞来源的exosomes能够促进OVA免疫小鼠B细胞表面CD86和MHCⅡ分子的表达,且具有剂量依赖性。此外,CD4⁺T细胞exosomes也能够促进B细胞增殖和抗体的产生。有趣的是,相较于WT-T-Exo,抗原特异性的OVA-T-Exo在促进OVA免疫小鼠来源B细胞的活化、增殖以及抗体产生方面,显示出了更强的作用。（5）成功建立了CD40L敲减EL-4细胞系,提取并制备了CD40L敲减EL-4细胞来源exosomes,简称为EL-4^{CD40L ShRNA} Exo,对照exosomes简称为EL-4^{NC Sh RNA} Exo。结果显示,EL-4^NC ShRNAC ShRNA Exo处理组B细胞表面CD86和MHCⅡ的MFI分别为1124±158.9和6565±623.9,而EL-4^{CD40L ShRNA} Exo处理组B细胞表面CD86和MHCⅡ分子的表达显著降低（P<0.05）,其MFI分别为430.5±53.18和3300±468。此外,与对照组相比,EL-4^{CD40L ShRNA} Exo处理组B细胞的增殖能力明显下降,培养上清中的IgG水平也显著降低（P<0.01）。结论（1）成功制备了CD4⁺T细胞exosomes,其能够促进小鼠骨髓浆细胞比例增高,抗原特异性CD4⁺T细胞exosomes能够促进HBsAg疫苗接种小鼠产生HBsAb抗体,且主要是Th1型抗体。（2）CD4⁺T细胞exosomes体外主要与B细胞结合,能够促进B细胞活化、增殖以及抗体产生,其作用部分依赖于CD40L分子。