论文部分内容阅读
第一部分人B7-H3分子siRNA的设计及siRNA转染条件优化目的：设计并化学合成人B7-H3基因的小分子干扰RNA，并进一步优化转染人胰腺癌Patu8988t细胞的条件。方法：遵循RNA干扰目标序列的选取原则，利用互联网资源对人B7-H3基因mRNA序列设计4条小干扰RNA（siRNA）。以阴性荧光素特异性siRNA为报告基因，通过脂质体Lipofectamine2000转染人胰腺癌Patu8988t细胞，利用荧光显微镜计数观察转染效率，CCK-8法检测转染后对人胰腺癌Patu8988t细胞的毒性。结果：成功设计并合成4对人B7-H3基因的小分子干扰RNA，在96孔板中筛选出最优化的转染条件为0.125μL Lipofectamine2000和5pmol siRNA。结论：成功设计并合成了人B7-H3基因的小分子干扰RNA，同时优化的最佳转染条件为进一步研究人B7-H3小干扰RNA功能提供了条件。第二部分B7-H3小干扰RNA对人胰腺癌Patu8988t细胞生长的影响目的：研究B7-H3siRNA对B7-H3高表达的人胰腺癌Patu8988t细胞增殖的影响。方法：从化学合成的4对小干扰RNA中筛选出最佳的靶向B7-H3siRNA转染人胰腺癌Patu8988t细胞，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western印迹分别从mRNA和蛋白水平检测B7-H3表达，CCK-8检测B7-H3表达被抑制后细胞增殖的情况。结果：B7-H3siRNA能在mRNA和蛋白水平下调人胰腺癌Patu8988t细胞中B7-H3基因的表达（P<0.01）。B7-H3表达被抑制后，细胞生长未受到明显抑制（P＞0.05）。结论：沉默B7-H3基因对胰腺癌Patu8988t细胞生长无明显抑制作用。第三部分B7-H3siRNA干扰联合吉西他滨对人胰腺癌Patu8988t细胞生长的影响目的：研究B7-H3siRNA干扰联合吉西他滨对人胰腺癌细胞Patu8988t生长的影响方法：选择适合的GEM的干预浓度为10μmol/L。设立空白对照组（B）：未干预空白细胞。GEM干预对照组（B+）：单纯GEM干预；联合干预对照组（NC+）：阴性对照siRNA转染联合GEM干预；联合干预实验组（4+）：B7-H3siRNA转染联合GEM干预。通过CCK-8法检测各组细胞增殖情况。应用Annexin-V/PI双染色法，检测各组细胞早期凋亡情况。运用RT-PCR检测各组Caspase-3mRNA、Caspase-8mRNA、Caspase-9mRNA、Bcl-2mRNA和Bax mRNA的表达。并且应用Caspase活性试剂盒检测各组的Caspase-3, Caspase-8and Caspase-9酶活性。结果：联合干预实验组细胞较其他对照组增殖明显减低（p＜0.01）,其早期凋亡比例为(25.83±0.95)%较GEM干预对照组(18.6±0.76)%和联合干预对照组(20.30±1.08)%明显增高(P<0.01)。联合干预实验组的Caspase-3mRNA, Caspase-8mRNA,Caspase-9mRNA的表达较对照组明显上调(P<0.05)，其Caspase-3, Caspase-8andCaspase-9酶活性也较对照组明显增加(P<0.05)；而其Bcl-2mRNA和Bax mRNA表达水平较对联合干预对照组无明显变化。结论：B7-H3沉默可提高Patu8988t对于吉西他滨的化疗敏感性，其机制可能是通过增加细胞凋亡实现的。