随着现代交通工业和高空作业的发展,特别是具有死亡率高、致残率高特点的重型颅脑创伤的发病率逐年升高。重型颅脑创伤具有死亡率高、致残率高的特点,而其导致死亡的一个重要原因就在于脑干生命中枢受损。研究证实,脑干生命中枢存在一个产生和调节呼吸节律的特殊结构·——pre-Botzinger复合体(pre-Botzinger Complex, preBotC),这为研究脑干抑制特别是呼吸功能不全提供了更加精确的“靶点”。而蛋白组学作为一种系统生物学方法,具有全面、高通量的特点,更适合于描述颅脑创伤后呼吸功能变化这类复杂的机体生物变化。本实验在制备颅脑创伤合并呼吸功能不全动物模型的基础上,应用蛋白组学的方法,以脑干呼吸中枢preBotC为研究对象,应用基于液相色谱——质谱技术的蛋白非标记定量技术建立preBotC差异蛋白谱,并对差异蛋白进行功能分析,进一步探索颅脑创伤合并呼吸功能不全时呼吸中枢preBotC的蛋白质变化,为进一步治疗创伤后呼吸功能不全提供可能的靶标。一、大鼠重型颅脑损伤合并呼吸功能不全模型的建立及脑干呼吸中枢的定位目的：研究大鼠重型颅脑损伤合并呼吸功能不全动物模型的制备方法,探讨脑干呼吸中枢的定位方法,为进一步研究重型颅脑创伤合并呼吸功能不全提供模型基础,为脑干呼吸中枢的取材提供方法学依据。方法：利用液压致伤装置对雄性SD大鼠致伤,制备重型颅脑伤模型(峰压力2.7-2.8 atm),根据伤后2h血气分析筛选合并呼吸功能不全组(简称实验组)。通过延髓舌下神经处定位preBotC解剖平面,再通过其特异性NK1R免疫组化染色,精确定位其在舌下神经平面的具体位置。结果：大鼠致伤后均出现呼吸慢、血压低、心率慢等脑干抑制现象,以呼吸变化最为显著。所有动物伤后均立即出现短暂呼吸暂停,持续时间由1-10分钟不等。动物呼吸机辅助呼吸后,80.0%(36／40)大鼠能恢复自主呼吸但不规则,并最终有33只动物(82.5%)符合血气分析标准纳入重型颅脑伤合并呼吸功能不全组(简称‘实验组’)。结论：本实验成功地建立了大鼠重型颅脑损伤合并呼吸功能不全模型,该模型稳定性好、重复性好,呼吸变化明显,致伤动物通过及时有效的辅助呼吸可存活2小时以上。以舌下神经处为解剖定位标志,成功制备了包含在舌下神经在内的preBotC组织切片,并以NK1R免疫组化的方法精确定位了脑干呼吸中枢preBotC。二、大鼠重型颅脑损伤preBotC的差异蛋白谱研究——“蛋白非标记定量技术”目的：探讨大鼠重型颅脑损伤后preBotC差异蛋白谱的建立方法,建立大鼠重型颅脑损伤preBotC的差异蛋白谱,为大鼠重型颅脑损伤preBotC的差异蛋白谱的功能分析提供研究基础。方法：提取样品总蛋白后按Bradford法测定总蛋白浓度,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测总蛋白分布,对其进行酶切预处理后采用基于液相色谱-质谱技术的蛋白非标记定量技术(Label-free LC-MS)进行分析,进行数据库检索得到重型颅脑损伤preBotC差异蛋白谱,并对此谱行聚类分析。结果：大鼠重型颅脑伤脑干呼吸中枢差异蛋白谱共74种差异蛋白(差异倍数为2倍,p<0.05),其中表现为上调的差异蛋白为34种,表现为下调的有40种。结论：建立和完善了脑干preBotC等脑组织深部核团的定量蛋白组学处理和检测方法,该方法稳定性、重现性好,定量精确度高,是一种较好的脑组织深部核团定量蛋白组学检测方法。成功建立了重型颅脑损伤脑干呼吸中枢的差异蛋白谱。三、大鼠重型颅脑伤脑干呼吸中枢差异蛋白谱的功能分析目的：对大鼠重型颅脑伤脑干呼吸中枢差异蛋白谱进行功能分析,为重型颅脑损伤的治疗提供可能的新靶点。方法：采用基因本体学分析(Gene Ontology analysis)对重型颅脑伤preBotC差异蛋白谱从系统学高度进行功能显著性分析,得到差异蛋白谱对应的的显著性变化功能表,同时构建显著性变化功能间的关系网络图(GO Map)。结果：根据大鼠重型颅脑伤preBotC显著性变化功能表和功能关系网络图分析表明,与preBotC74种差异蛋白相对应的显著性变化功能为128种,其中表现为功能上调的为94种,表现为功能下调的34种。同时表明与细胞内蛋白转运,突触小泡转运,神经元分化,腺嘌呤代谢,微管解聚,再生与愈合、组胺摄取与转运,黑色素代谢,退行性蛋白转运,对损伤刺激的反应,能量代谢等九种病理生理变化相关。结论：大鼠重型颅脑伤脑干呼吸中枢(preBotC)差异蛋白谱主要参与的显著性功能为细胞内蛋白转运,突触小泡转运,神经元分化,腺嘌呤代谢,微管解聚,再生与愈合、组胺摄取与转运,黑色素代谢,退行性蛋白转运,对损伤刺激的反应和能量代谢等,其中与呼吸功能直接相关的是黑色素代谢蛋白,微管解聚蛋白和能量代谢蛋白等。