研究背景由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的结核病(tuberculosis,TB)是世界最普遍的传染病之一,并且扩散到大约全球人口的三分之一。宿主防御系统在结核病患者中至关重要,那些耐药结核病患者,使用一线抗MTB药物异烟肼(INH)并不能治愈,但可通过MTB感染诱导的干扰素(IFN)产生,作为有效的抗病毒免疫调节剂从而引起对包括细菌感染在内的各种病原体的多种免疫应答。因此,干扰素或与一线抗生素联合使用已被认为是治疗结核病的有效方法,特别是临床上的耐药患者,结合其特异性受体后,干扰素会导致信号转导和转录激活因子的磷酸化(STAT)分子和干扰素刺激基因(ISGs)的产生,以使宿主进入防御状态。先前的一项研究表明作为最重要的ISG之一,转录激活因子干扰素调节因子1(IRF1),可以有效调节对病原体感染的免疫反应。IRF1可靶向诱导NO合成酶(iNOS)产生,消除感染小鼠的分枝杆菌。在病毒感染期间,IRF1通过IFN产生和/或激活细胞培养模型中的JAK-STAT级联通路有效地限制病毒复制。此外,IRF1通过调节巨噬细胞(Mφs)的MI极化来发挥抗肿瘤功能,并通过调控雷帕霉素信号传导(mTOR)信号传导的机制靶标来影响肿瘤转移和上皮-间充质-转变(EMT)。最近的研究表明mTOR在细胞生长和代谢控制中发挥关键作用,例如调节翻译,转录,营养摄取,核糖体生物合成和自噬以响应环境因素,可利用它来促进宿主细胞防御机制,防御包括MTB等病原体的入侵。IRF1在不同环境中的mTOR信号传导的激活和抑制中起重要作用,核糖体p70 S6激酶(p70S6K)和自噬是mTOR关键的下游效应物,猜测其调控作用可作为MTB感染的宿主靶向疗法。鉴于IRF1在先天免疫反应中的重要性以及对MTB控制机制研究不足,我们探究了 IRF1对MTB感染中的作用机制。我们发现IRF1能由肺结核患者和体外MTB感染引起表达上调,此外通过在Mφ中以自噬非依赖形式抑制mTOR/p70S6K信号传导,确定了 IRF1在促进抗分枝杆菌作用中的新型宿主防御功能。我们进一步证明,一线TB药物INH治疗可以协同增强mTOR/p70 S6K信号传导活性的降低和促进IRF1的抗分枝杆菌作用。研究内容1.发现PTB患者PBMC及巨噬细胞和MTB感染的人原代巨噬细胞中IRF1高表达并发现其能限制感染结核分枝杆菌巨噬细胞胞内菌的生存;2.通过检测巨噬细胞中常见胞内菌杀伤途径探究IRF1在巨噬细胞中具体参与的抗结核途径;3.验证IRF1通过mTOR抑制核糖体蛋白S6激酶限制结核杆菌。研究方法1.结核杆菌感染促进病人和体外细胞IRF1的表达1)通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测PTB患者与健康志愿者的外周血单个核细胞(PBMCs)中ISGs的表达;2)采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测PTB患者与健康志愿者的骨髓来源的巨噬细胞(hMDMs)中ISGs的表达;2.IRF1限制感染结核分枝杆菌巨噬细胞胞内菌的生存1)通过构建IRF1-RFP稳定表达的THP-1过表达细胞系,通过激光显微镜及免疫荧光染色技术观察IRF1-THP-1过表达细胞系RFP的表达情况,并通过Real-time PCR和Western Blot检测IRF1过表达效果,随后进行毒株H37Rv及疫苗株(BCG)平板菌落计数实验(CFU)检测在过表达IRF1后对巨噬细胞杀菌效果的影响;2)人原代巨噬细胞及THP-1巨噬细胞中通过脂质体转染靶定IRF1的siRNA 沉默 IRF1 表达,并通过 Real-time PCR 和 Western Blot 检测 IRF1的沉默效果,随后进行毒株H37Rv及疫苗株(BCG)平板菌落计数实验(CFU)检测在过表达IRF1后对巨噬细胞杀菌效果的影响;3.IRF1在感染结核分枝杆菌巨噬细胞中的抗菌炎症反应有重要作用1)在hMDM沉默IRF1后感染BCG,通过Real-time PCR检测参与胞内氧化还原反应抑菌的指标 iNOS、Dual oxidases 2(DUOX2)、NADPH oxidase 1,2和 5(NOX1,2和 5);2)在hMDM沉默IRF1后感染BCG,通过Real-time PCR检测报导参与胞内杀伤MTB的抗菌肽hBD1和LL37的表达;3)在hMDM沉默IRF1后感染BCG,通过Real-time PCR和Luminex检测hMDM中参与杀菌的主要炎症因子IL-6,IL-8,TNF,IFN-α,IFN-β,IFN-γand IL-10的表达情况及分泌情况,并通过Real-time PCR检测IRF1是否参与基质金属蛋白酶Matrix metalloproteinases(MMPs)的表达。4)从ENCODEChIP-seq实验基因数据库检索IRF 1的全基因组染色质免疫沉淀-测序(ChIP-seq)数据显示IRF1直接结合IFN信号传导的关键元件STAT1的启动子区,通过Real-time PCR和Western Blot检测BCG和H37Rv感染条件下IRF1过表达对STAT1和其他ISGs的表达。4.IRF1通过抑制mTOR信号通路控制胞内结核分枝杆菌1)有文献报导促分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)p38亚型、半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase-1)的激活和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的激活都与IRF1有关。因此通过Western Blot检测BCG和H37Rv感染条件下IRF1对p38的磷酸化水平、caspase-1前体和caspase-1剪切体p10的情况的影响;2)hMDM中转染siRNA沉默IRF1,通过Western Blot检测MTB感染后mTOR的磷酸化水平。并通过Western Blot检测在IRF1-THP-1细胞系中检测过表达IRF1对p-mTOR和p-AKT表达的影响。3)同时,在IRF1沉默和过表达细胞中添加渥曼青霉素(Wortmanin)预处理,通过Western Blot检测对AKT的抑制作用及CFU实验检测能否恢复IRF1的抗菌作用;4)在IRF1沉默和过表达细胞中添加雷帕霉素(Rapamycin)预处理,通过Western Blot对检测mTOR磷酸化水平的影响及CFU实验检测对IRF1的抗菌作用的影响。5.IRF1独立于自噬机制抑制胞内结核分枝杆菌1)在巨噬细胞中沉默IRF1,并通过Western Blot和共聚焦显微镜分析检测LC3-II(自噬体膜中发现的脂质形式的LC3)的表达和LC3斑点和溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)的形成;2)通过Real-time PCR和Western Blot检测IRF1对自噬体相关蛋白包括Atg5,7和12等Atgs的表达水平的影响。3)在IRF1-THP-1细胞中,添加自噬直接抑制剂3-Methyladenine(3-MA)预处理,Western Blot检测LC3-II蛋白表达,并用CFU实验检测能否恢复IRF1介导的对H37Rv的存活抑制情况;6.IRF1通过mTOR抑制核糖体蛋白S6激酶限制结核杆菌1)在MTB感染THP-1-Mφ和hMDM的条件下沉默IRF1,通过Western Blot检测mTOR底物p70 S6K的磷酸化水平。同时,通过Western Blot检测在IRF1过表达情况下mTOR和磷酸化p70 S6K的表达情况;2)在 IRF1-THP-1 Mφ添加p70 S6K抑制剂PF 4708671及mTOR 激动剂MHY 1485,通过Western Blot检测p70 S6K的表达影响,并通过CFU实验检测对H37Rv存活情况的影响;3)为探究INH和IRF1过表达对mTOR和p70 S6K磷酸化的组合效果,通过Western Blot检测INH对IRF1抑制mTOR和p70 S6K的磷酸化水平的影响。研究结果1.结核患者PBMCs及hMDMs和MTB感染的hMDMs及THP-1 Mφ中的IRF1表达水平上调;2.IRF1促进hMDMs及THP-1 Mφ中对胞内MTB的杀伤作用;3.IRF1在感染结核分枝杆菌巨噬细胞中的抗菌炎症反应有重要作用,但不参与这些抗菌炎症对胞内结核分枝杆菌的杀伤作用;4.IRF1通过mTOR抑制p70 S6K活性控制胞内MTB的生存。结论本课题研究发现,IRF1在肺结核患者的PBMC和单核细胞中及MTB感染体外培养的巨噬细胞均能被显着诱导,提示IRF1参与MTB感染巨噬细胞过程。此外,本课题研究发现IRF1能促进几种常见参与胞内抗菌的促炎细胞因子包括IL-6,TNF-α和IL-8的表达,表明IRF1参与介导MTB感染后天然免疫的激活。进一步功能性过表达及沉默IRF1实验证明IRF1能通过抑制雷帕霉素(mTOR)/p70 S6激酶(p70 S6K)级联的机制靶标以发挥其抗MTB效应。以上结论提示,本课题研究发现了 IRF1的新功能,其通过抑制Mφ中的mTOR/p70 S6K信号传导来促进抗分枝杆菌的作用可以为结核病的治疗提供精准靶点。