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精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase, EC 3.5.3.6),简称ADI,作为一种精氨酸降解酶,被认为是极具潜力的新型抗癌药,其针对原发性肝细胞癌(HCC)、黑素瘤等精氨酸缺陷型肿瘤具有明显的治疗作用。此外,研究表明,ADI对于急性淋巴细胞白血病的疗效要明显优于L-天冬酰胺酶。然而,目前所有应用于临床研究的ADI都来源于支原体(Mycoplasma arginini),将其作为一种作用于人体的药物来源,存在一定的安全隐患；且已报道的ADI在人体生理条件下普遍存在酶活力低、底物亲和性弱、半衰期短等局限性。因此,寻找更加安全、高效的ADI具有重要意义。本研究以一株精氨酸双水解酶阳性的益生性乳酸菌—短乳杆菌(Lactobacillus brevis CGMCC 1306)为材料,在分析该菌株精氨酸代谢特征、解析精氨酸水解基因簇基础上,首次克隆了其ADI编码基因,实现了原核异源表达,并对重组酶的酶学性质进行了研究,为进一步探索其应用奠定了实验基础。主要结果如下：精氨酸水解产物谱分析显示,L. brevis CGMCC 1306具有完整的精氨酸水解系统,在弱酸性条件下,该菌可以通过ADI、鸟氨酸氨基甲酰转移酶(OCT)及氨基甲酸激酶(CK)依次将精氨酸降解为瓜氨酸、鸟氨酸和磷酸氨甲酰,同时产生ATP、CO2和NH3。精氨酸水解相关基因克隆分析显示,这些相关基因在菌株基因组上聚集成簇,且其组成结构为：arcABDTCR,这与目前已报道其它微生物的精氨酸水解基因簇结构及组成差异明显。采用PCR扩增获取该菌株编码ADI的arcA基因,序列分析结果表明该片段开放读码框为1233 bp,编码410个氨基酸,其蛋白计算分子量为45.9 kDa。Blast分析显示,该基因序列与L.brevis KB290的arcA序列仅存在一个差异碱基,且两者的氨基酸序列相一致；与米曲霉乳杆菌(Lactobacillus oryzae JCM 18671)和布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri NRRL B-30929)蛋白相似性分别高达91%与82%；而相比于已报到的其它非乳酸菌,如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和M. arginini,尽管其蛋白序列相似性均仅有34%,但它们都具有相同的保守结构域(FTRD, EGGD, MHLDT和CMSxP)和催化中心(C-H-G)。将获得的arcA片段克隆至pMD18-T载体,测序验证后进一步亚克隆至表达载体pET-28a(+)中并构建重组表达工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET-28a-ADI。对重组菌株进行IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明重组ADI获得了表达。然而,该重组ADI对咪唑高度敏感,具有催化活性的粗酶液经Ni-NTA亲和层析后,失去催化能力,且充分透析后,其催化活力仍不能恢复。于是本研究进一步构建了表达非冗余ADI的重组载体pET-21a-ADI及工程菌株E. coli BL21 (DE3)/pET-21a-ADI,将其粗酶液通过HiPrep DEAE FF离子交换层析和SeperdexTM G-200凝胶过滤进行分离纯化后得到电泳纯的重组ADI,每升诱导培养物可获得2.8 mg重组蛋白,其比活力为71.5 U/mg,纯化倍数为55倍,回收率为47.7%。凝胶过滤液相色谱测得重组ADI的蛋白分子量大小为183 kDa,而SDS-PAGE凝胶电泳显示其单体大小约为46 kDa,因此推断该重组酶为同源四聚体。对重组ADI的酶学特性进行研究,结果表明,其最适反应温度为60℃、最适pH为6.0,其在60℃条件下半衰期为10 mmin,且40 min后已不能检测到活性。动力学常数测定结果显示其Km值为1.79 mM, Vmax为1.69 μmol/s·mL,因此该ADI具有较强的底物结合能力。