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肥胖引起的外周组织胰岛素抵抗是2型糖尿病发生的重要病理基础。本课题研究表明肥胖患者血清中miR-204含量显著高于正常体重人群。但肥胖患者血清高水平miR-204的组织来源,以及其与肥胖胰岛素抵抗的关系尚不清楚。胰岛组织是胰岛素主要来源,是人体内重要的内分泌器官,具有外泌功能,已有研究证实肥胖胰岛功能损伤后,会以外泌体形式分泌大量miRNA入血[1],发挥生物学活性。鉴于miR-204高度富集于胰岛组织,胰岛组织具有分泌功能,且肥胖患者血清高表达,因此推测血清富含miR-204可能来源于胰岛组织。但是miR-204是如何发挥诱导肥胖胰岛素抵抗作用尚有待验证。生物信息学预测表明miR-204直接抑制SIRT1的表达。而SIRT1是胰岛素抵抗调控重要靶蛋白,在葡萄糖摄取的主要效应器官骨骼肌中SIRT1可直接或间接影响骨骼肌胰岛素信号通路,改善胰岛素抵抗[2]。综上所述,我们提出本研究假说,肥胖状态下胰岛可能以外泌体包裹形式释放miR-204到血清中,进而通过抑制骨骼肌组织SIRT1,影响下游胰岛素经典信号转导通路,诱发骨骼肌胰岛素抵抗。本研究通过采集临床肥胖儿童血清、高脂饮食喂养建立C57BL/6J肥胖小鼠模型、骨骼肌细胞过表达miR-204模型、棕榈酸处理的胰岛细胞及胰岛细胞miR-204沉默上清液共培养的骨骼肌细胞模型,明确miR-204参与肥胖诱发骨骼肌胰岛素抵抗,探讨miR-204通过抑制SIRT1调控骨骼肌胰岛素信号通路的作用机制,阐明肥胖状态下,胰岛分泌含miR-204外泌体诱导骨骼肌胰岛素抵抗的作用机制,揭示在肥胖诱导骨骼肌胰岛素抵抗中miR-204的关键作用。以下为本论文的研究内容。1.探讨miR-204与肥胖诱发骨骼肌胰岛素抵抗的相关性。本实验部分通过收集临床肥胖儿童血清、高脂饮食喂养建立C57BL/6J肥胖小鼠模型,检测临床儿童血清及肥胖小鼠骨骼肌组织miR-204、血糖等水平,结果显示肥胖儿童血清miR-204与肥胖程度、空腹血糖等水平呈正相关;肥胖小鼠4周口服葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验结果显示高脂喂养的小鼠出现胰岛素抵抗症状,与此同时肥胖小鼠骨骼肌miR-204水平随高脂喂养的进行在3周开始显著升高,并在模型制备过程中维持在高水平表达,血清和骨骼肌中miR-204随肥胖的发展而升高,且升高的miR-204参与肥胖诱发胰岛素抵抗的调控。提示miR-204与肥胖诱发胰岛素抵抗有关。2.明确miR-204通过抑制SIRT1诱导骨骼肌胰岛素抵抗的作用机制为了探究升高的miR-204及其靶蛋白SIRT1在骨骼肌胰岛素抵抗机制中扮演的角色,本实验部分进一步在C2C12小鼠骨骼肌细胞过表达miR-204并联合SIRT1激活剂白藜芦醇,检测骨骼肌细胞糖摄取及胰岛素信号通路蛋白的表达。结果显示,C2C12骨骼肌细胞过表达miR-204后,SIRT1表达显著下降,进而引起骨骼肌胰岛素信号通路关键信号分子Akt和下游膜转运子Glut4表达显著下降,且胰岛素刺激下的p-Akt蛋白激活能力显著下降,细胞糖摄取能力显著下降,;C2C12骨骼肌细胞过表达miR-204并联合应用SIRT1激活剂白藜芦醇后,SIRT1表达显著上调,骨骼肌胰岛素信号通路葡萄糖转运子Glut4表达显著上调,且胰岛素刺激下的p-Akt的蛋白表达水平有所上调,细胞糖摄取能力显著上调。以上结果显示在肥胖状态下,骨骼肌miR-204水平显著增加,且过表达miR-204能够引起骨骼肌细胞胰岛素抵抗,其潜在机制可能是通过抑制SIRT1。3.阐明胰岛分泌的含miR-204外泌体能被骨骼肌摄取并诱导胰岛素抵抗发生。本部分实验首先在临床肥胖儿童血清和棕榈酸处理的小鼠骨骼肌C2C12细胞和胰岛细胞模型中,检测血清、骨骼肌细胞、胰岛细胞内和胰岛细胞上清液miR-204水平,进一步提取血清和细胞上清液外泌体,采用透射电镜和标记蛋白CD63进行外泌体鉴定,并检测外泌体内miR-204水平。将血清外泌体和上清液内外泌体与骨骼肌细胞共培养后进行免疫荧光检测,验证胰岛细胞能够释放含miR-204外泌体并被骨骼肌细胞摄取。进一步沉默胰岛细胞内的miR-204,用沉默miR-204后棕榈酸处理的胰岛细胞上清液提取外泌体重悬液孵育骨骼肌细胞,孵育48 h后,检测骨骼肌细胞糖摄取、糖消耗的变化,验证胰岛分泌的含miR-204的外泌体被骨骼肌摄取后可引起骨骼肌胰岛素抵抗。结果显示不同浓度棕榈酸处理下骨骼肌细胞内miR-204含量并无明显差异,提示胰岛素抵抗条件下骨骼肌升高的miR-204水平可能不由自身合成。肥胖儿童血清内miR-204水平显著升高,血清外泌体内miR-204水平呈相同趋势;棕榈酸处理的胰岛细胞上清中miR-204水平升高,说明肥胖状态下,胰岛细胞能够分泌含miR-204外泌体,且临床儿童血清和棕榈酸处理过的胰岛细胞上清液外泌体均能够被骨骼肌细胞摄取。与棕榈酸处理过的胰岛细胞上清外泌体共培养的骨骼肌细胞糖摄取,糖消耗能力显著下降,而沉默miR-204后上述情况得到明显改善。结果表明,胰岛分泌含miR-204外泌体可被骨骼肌细胞摄取并诱发骨骼肌胰岛素抵抗。综上,本论文提出了1.miR-204通过抑制SIRT1引起的肥胖诱发的骨骼肌胰岛素抵抗;2.胰岛细胞以外泌体形式分泌miR-204,且能够被骨骼肌细胞摄取;3.胰岛细胞分泌的含miR-204外泌体能够引起骨骼肌胰岛素抵抗,其机制可能是通过miR-204抑制靶基因SIRT1影响骨骼肌葡萄糖摄取能力。本实验为胰岛与骨骼肌组织在肥胖模型中的串联通路提供了新机制,为后续药物干预、治疗提供了新方向。