研究背景: 神经损伤后的修复与再生一直是国内外学者重点研究的课题，但迄今仍未找到令人满意的提高功能恢复率的方法。其主要原因就是周围神经损伤后，同一神经束的远近端往往不能准确对接导致的运动或感觉神经纤维之间的错向吻合。因此，神经损伤修复术中，最理想的是能做到相同功能性质的神经束进行准确对接。这就对神经内各神经束的定性和定位研究提出了更高的要求。由于神经干内部各神经束的组成在功能性质上互相交叉混合，已有的部分神经断层功能束组定位图谱仅提供了神经在某一平面的二维图像信息，根本不能反映此神经在其全程中神经束交叉重组的错综复杂变化过程，因此如何精确地显示神经内部神经束和神经纤维的错综复杂的立体结构已成为该领域的当务之急。而完成对这一层面解剖与生理机能的三维可视化系统可能是一重要有效途径。此外，周围神经组织工程学研究发现，仿生化的神经修复材料的空间结构具有关键性作用，这就需要我们对周围神经的亚显微结构有清楚的认识，以便于模仿；且神经缺损选择组织工程化人工神经修复也必须按照匹配性原则从虚拟神经数据库中获取参数信息。通过周围神经功能束三维可视化系统建立一个相对准确完整的虚拟周围神经数据库，还将在各种神经与亚神经单位的移位、移植的合理选择，各种神经损伤与疾病的精细诊断与准确定位，神经显微解剖的直观教学等方面均具有重要的价值。 由此可见，进行周围神经功能束三维可视化系统的开发作为今后周围神经领域更高水平的教学、科研和临床应用的研究平台和技术支撑，已经成为阻碍周围神经外科进一步发展的一个瓶颈问题亟待解决。 目前，基于神经连续组织切片和AChE染色的周围神经功能束三维可视化研究尚处于初始阶段，由于周围神经内外部的信息难以抽取，至今全世界还没有完整的神经系统三维可视化模型。周围神经功能束三维可视化系统的开发研究作为一个需要医学与计算机科学互相协作的跨学科课题，面临众多的技术难题，重建软件固然是最后的体现形式，但三维重建计算机编程需考虑的相关医学因素包括怎样才能获取达到目的又能为计算机所识别的二维图像，其图像制作的标准技术流程；在从二维向三维转化过程中会遇到哪些困难，怎样在符合医学规律又能达到目的的情况下去寻找计算机语言能接受的方法予以解决，现市售可用的一些普通三维重建软件在应用于神经可视化研究的过程中的可适性怎样，还存在哪些必须考虑而尚未考虑的因素，这些都是急待解决的问题。本研究针对这一需求，基于周围神经连续组织切片和AChE染色，拟对三维重建可视化周围神经功能束的前期技术流程、标准化图像获取及连续组织切片的图像配准和分割等关键技术路线进行研究，并尝试市售三维重建软件重建的可适性，为今后计算机科学开发相关软件提供医学背景和技术要求，从而为进一步确立成熟标准的技术路线提供合理化建议。 目的: 1.通过图像分析观察Karnovsky-Roots铁氰化铜法乙酰胆碱酯酶24h内染色规律，确定可作为周围神经功能束三维重建切片染色识别功能束性质的标准孵育时间。 2.通过对比3.0T核磁共振、神经横断染色切片镜下显微摄影和神经横断染色切片扫描仪扫描获得的数字化神经断面二维图像的特点，并尝试不同的图像拼接软件对周围神经横断染色切片40和100倍光学显微镜下矩阵图像的拼接对比，以评价可用于神经功能束三维重建获取二维全景图像的适合方法，选取实现高倍镜下获取神经切片二维全景图像最优的图像拼接软体，并确定合理的放大倍数。 3.以胭窝段5cm腓总神经为研究对象，确立基于Photoshop实现连续神经组织切片二维图像的配准和分割技术流程，通过Amira三维重建软件观察腓总神经功能束三维重建的效果，验证该技术流程的可靠性，评价Amira用于周围神经功能束三维重建的可适性，为今后计算机科学开发相关软件提供医学要求和技术要求，从而为制定成熟标准的技术路线提供合理化建议。此外，通过对胭窝段腓总神经的三维重建，观察其功能束的变化规律，为临床腘窝段腓总神经损伤的修复提供指导性建议。 材料和方法: 1.新鲜成人截肢腓总神经标本，横断面连续冰冻切片，片厚10μm，共切取56张切片。随机分为7组，每组8张切片，其中1～6组分别为1h组、2h组、4h组、8h组、12h组和24h组，第7组为阴性对照组。Karnovsky-Roots铁氰化铜法AChE组织化学孵育，在光学显微镜下观察不同染色时间下神经纤维成分染色特点，用Image-ProPlus6.0图像分析软件对不同时间染色组图像进行图像分析，分析指标为AChE反应阳性区域的面积、平均光密度和累积光密度。 2.MRI神经横断图像为1名正常健康成年男性腘窝段腓总神经；神经横断切片为新鲜成人截肢腘窝段腓总神经及腕段正中神经，各切取10张，共20张切片，腓总神经切片5张行HE染色，5张行AChE染色，正中神经切片5张行HE染色，5张行AChE染色；神经横断染色切片图像分别采取显微镜下系列矩阵摄影和扫描仪扫描获取二维全景图像。对神经染色切片分别进行40倍和100倍镜下系列摄影图像，应用Autositch、PanoramaMaker及Photostitch等三种图像拼接软件进行图像拼接实现二维全景图像获取，对比软件优缺点及AChE染色神经切片40倍和100倍二维全景图像的特点。从是否含有神经功能束生理信息、神经束轮廓是否清晰等角度，对比分析3.0T核磁共振、神经横断染色切片镜下显微摄影和神经横断染色切片扫描仪扫描获得的数字化神经断面二维图像的特点。 3.基于Photoshop7.0建立一套实现神经连续切片二维手工图像配准和分割的标准操作技术流程，以腘窝段5cm腓总神经为研究对象，基于连续组织冰冻切片和AChE组织化学染色，图像拼接获取100倍镜下二维全景图像，通过Amira3.1进行腓总神经功能束三维重建；3.0TMRI对1名健康成年男性腘窝段进行横断成像，根据神经在MRI上的成像特点，使用绘图板在MRI二维图像中手工分割腓总神经，以及胫神经、腘动脉和骨的轮廓，应用Amira3.1进行腓总神经复合骨、胭动脉和胫神经的三维重建。通过两种解剖水平腓总神经三维重建的效果对比，分析周围神经功能束三维可视化研究技术路线的难题和对进一步研究的要求。 结果: 1.孵育时间由1h至24h，镜下观察，周围神经运动有髓纤维和交感神经无髓纤维染色面积和强度呈递增趋势，8h～24h染色结果可明确鉴别神经束功能性质，以24h效果最佳，但24h染色结果存在过度染色；图像分析阳性区域面积8h<12h<24h，两两对比，均P<0.05；平均光密度8h<12h>24h，P(8h-12h)<0.05，P(12h-24h)>0.05；累积光密度8h<12<24h，两两对比，均P<0.05，结合24h染色结果存在过度染色，说明孵育12h后染色效果已经足够充分。孵育12h～24h间的切片，染色效果趋于一致，染色结果稳定可靠，神经束功能性质鉴别容易，神经束膜与染色的神经纤维间有清晰的分界。 2.三种拼接软件中以Autositch拼接效果最佳，自动化程度最高；100倍光学显微镜下获取的图像分辨率较40倍高，无需物理放大也可清晰观察不同性质神经的染色效果，根据原始图像易于准确鉴别神经束功能性质。 3.(1)应用Amira3.1分别基于MRI断层图像和神经连续组织切片可实现腓总神经外轮廓和内部功能束的三维重建。腓总神经功能束的三维重建效果优于腓总神经大体解剖的三维重建效果。重建的5.0cm长的腓总神经内部功能束的三维结构，可直观的观察到神经内部不同性质功能束交叉融合的变化，并可以多彩色、透明或任意组合显示，并在其矢状轴、冠状轴、水平轴进行剖切和任意角度旋转观察，整体显示清晰、实体感强，相互关系一目了然。 (2)通过对200张腓总神经断面切片和重建三维模型的观察，腓总神经内部功能束的变化规律具有如下特点：①腓深神经和腓浅神经功能分区已非常明确；②腓深神经和腓浅神经在腓骨小头后方5cm内走行中无神经束交叉变化；腓浅神经感觉束与腓浅神经运动混合束之间无交叉变化；神经束的交叉变化主要存在于腓深神经混合束之间、腓浅神经感觉束之间和腓浅神经运动混合束之间；③神经束间的交叉融合大多在3～5mm走行范围内即完成，最长的一段交叉融合在10mm内完成。 结论: 1.周围神经Karnovsky-Roots法AChE组织化学染色12h～24h间，可作为周围神经功能束三维重建切片染色识别功能束性质的标准孵育时间条件。 2.100倍光学显微镜下获取的神经断面二维全景图像可满足周围神经功能束三维重建对二维图像的要求。 3.Autositch对光学显微镜下系列矩阵图像拼接效果佳，自动化程度高，适用于对大量连续神经组织切片高倍显微镜下系列矩阵图像的拼接以获取二维全景图像。 4.基于Photoshop确立的一套实现神经连续切片图像图像配准和分割的技术操作流程，三维重建效果证实可行； 5.Amira3.1可实现神经功能束三维重建，但对前期二维图像处理要求高，增加了工作量；Amira3.1不可以实现对单一数据通道重建结果的物理属性的赋予，不具备数据测量功能，不能进行任意角度的切割。 6.胭窝段腓总神经内腓深神经和腓浅神经功能解剖分区已明确，说明对该段腓总神经损伤修复时应进行准确的配对吻合。 7.胭窝段腓总神经内束型的交叉融合多在3～5mm内完成，最长的交叉融合为10mm。