第一部分异氟醚对老年小鼠学习记忆影响及可能机制研究背景和目的POCD是指手术麻醉后发生的定向力、学习、记忆、注意等方面的认知功能下降。1998年Moller等人进行的一项大规模多中心以健康人作为对照组的临床研究结果显示60岁以上人群非心脏手术后POCD发生率在1周内为25.8%,3个月时为9.9%。临床研究结果显示,老龄是术后认知功能障碍发生的独立危险因素。关于POCD发生的机制目前尚不清楚。吸入麻醉药在POCD发生中的作用近年来受到关注。吸入麻醉药的作用机制非常复杂,对中枢神经系统的影响表现在很多方面,其中包括增强脑内主要的抑制性神经递质γ—氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)受体的功能,抑制兴奋性神经递质谷氨酸N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受体的功能。环腺苷酸应答元件结合蛋白(cAMP response element bindingprotein,CREB)和早期生长反应因子-l(early growth response factor1,Egr1)作为转录因子在长时记忆的过程中起着重要作用,与神经元突触可塑性、NMDA受体以及GABA受体的功能密切相关,本实验的目的是研究在无手术的情况下,单独使用吸入麻醉药后小鼠学习记忆功能的改变,并且探讨其对记忆提取相关的CREB、Egr1的表达以及CREB激活的影响。方法老年C57/BL6小鼠接受Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)定位航行训练,训练周期14天,训练目的是使其形成利用提示物对隐蔽于水下的平台定位的空间参考记忆。考察指标是小鼠在空间探索实验中平台所在象限游泳的距离百分比超过30%。在空间参考记忆形成后,小鼠分为异氟醚组、氧气对照组和空气对照组。异氟醚麻醉组小鼠接受4小时异氟醚麻醉,浓度相当于1倍最低肺泡有效浓度(minimal alveolar concentration,MAC)。三组分别于麻醉结束后1天、1周和1个月重复空间探索实验。采用重复测量资料的双因素方差分析,及Bonferroni post test分别比较各时间点各组平台象限游泳距离百分比。选取空间探索实验中平台象限游泳距离占总距离百分比超过30%且较为接近的小鼠随机分入单纯水迷宫组(WM)、水迷宫+麻醉组(WM+Ane)和空白对照组(Na(i|¨)ve)。WM组仅接受水迷宫测试,WM+Ane组既接受麻醉,又接受水迷宫测试,Na(i|¨)ve组既不接受麻醉,也不接受水迷宫测试。麻醉于训练结束后第一天进行,水迷宫测试于麻醉后第1天、1周、1个月进行。在水迷宫空间探索实验结束后1小时处死小鼠,采用实时定量逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerized chain reaction,RT-PCR)检测Egr1和CREB的mRNA水平;空间探索实验后2小时处死小鼠,采用免疫荧光染色和免疫印迹的方法检测Egr1,免疫荧光染色方法检测激活的CREB(p-CREB)。组间积分光密度(免疫组化)、条带的相对光密度(免疫印迹)及校正后的基因拷贝数(RT-PCR)的比较采用单因素方差分析,并采用Bonferroni post test比较每两组之间的差异。认为P＜0.05时差异有统计学意义。结果麻醉过程中小鼠呼吸频率等生命体征正常,麻醉结束后血气分析正常。三组动物的平台象限距离百分比随时间呈现明显下降趋势(时间因素占总方差的百分比20.82%,P＜0.0001)。Bonferroni post test结果显示在麻醉后1天和1周麻醉组平台象限距离百分比明显低于两组对照组:麻醉后1天Ane vsActl:t=4.587,P＜0.001,Ane vs Vctl:t=3.822,P＜0.001;麻醉后1周Ane vsActl:t=2.733,P＜0.05,Ane vs Vctl:t=2.621,P＜0.05。而麻醉前及麻醉后1个月麻醉组Ⅳ象限距离百分与两组对照组相比差异无统计学意义:麻醉前Ane vs Actl:t=0.5158,P＞0.05,Ane vs Vctl:t=0.9029,P＞0.05;麻醉后1个月Ane vs Actl:t=0.5185,P＞0.05,Ane vs Vctl:t=0.3240,P＞0.05。免疫荧光染色和免疫印迹的结果显示麻醉后1天和1周WM+Ane组Egr1的蛋白表达明显低于WM组,至1个月时两组无明显差别。麻醉后1天WM+Ane组p-CREB的表达低于WM组,1周时两组无明显差别。RT-PCR结果显示麻醉后1天和1周WM+Ane组Egr1和CREB的mRNA表达量明显低于WM组,至1个月时两组差异无统计学意义。讨论及结论Morris水迷宫(MWM)是用于评价和比较啮齿类动物空间学习和记忆功能的有效工具,已得到行为生物学家和药理学家的普遍接受和广泛应用。我们的研究表明,单次异氟醚麻醉后1天、1周时老年小鼠空间记忆提取过程受到明显影响,但是1个月时这种影响消失。三组小鼠在异氟醚麻醉前平台象限游泳的距离百分比均超过30%并且无显著性差异,表明所有参与后续实验的小鼠均形成了对平台位置的空间记忆。接受异氟醚麻醉后第1天,异氟醚组目标象限游泳的距离百分比与麻醉前相比明显降低,而两个对照组仍维持麻醉前水平,两组对照组之间无显著性差异。至1周时,麻醉组和对照组差别仍很明显。而1个月时,三组之间无显著性差异。在我们的设计中排除了一些可能对学习记忆产生影响的其它因素,包括低血压、低氧血症等因素,通过与对照组进行同时间点的比较,我们认为在麻醉组术后1天和7天时平台象限距离百分比的突然下降,是异氟醚麻醉后产生的残余作用所致。我们观察到水迷宫空间探索实验中对先前记忆的提取过程可促进Egr1和CREB的表达及CREB的激活,在异氟醚麻醉后1天、1周,已形成对平台的位置的记忆的小鼠再次进行空间探索实验,即位置回想测试时,在蛋白以及mRNA水平Egr1的激活明显受到抑制,至1个月时这种抑制消失。这一时间演变过程与水迷宫行为学表现的改变一致,提示Egr1和CREB的合成受抑制可能是行为学实验中小鼠对平台位置的寻找行为的改变的分子机制之一。因此,我们的研究可以提示异氟醚麻醉影响小鼠已形成的空间参考记忆的提取过程,异氟醚对记忆提取的影响可能与抑制转录因子CREB的合成和激活以及Egr1的表达有关。第二部分七氟醚麻醉对新生小鼠脑发育的影响研究背景和目的随着儿科手术技术的发展,新生儿接受手术的机率和复杂程度均不断增加,接受较长时间全身麻醉的机会增多,因而研究麻醉药对发育期大脑的影响有重要意义。动物实验研究表明,在脑快速生长期(brain growth spurt,BGS)内接触NMDA受体拮抗剂和/或GABA受体激动剂可影响突触生长,导致发育期脑细胞凋亡明显增加,并可导致成年后的认知功能障碍。全身麻醉药作用复杂,其中一些具有增强GABA受体功能或拮抗NMDA受体的作用。临床常用的全身麻醉药中已有报道会促进实验动物发育期脑细胞凋亡的药包括:氯胺酮、氧化亚氮、咪达唑仑和异氟醚。七氟醚因为无刺激性气味,血-气分配系数低而广泛应用于儿科麻醉,尤其是麻醉诱导。七氟醚具有GABA受体激动作用。关于七氟醚对发育期脑细胞凋亡影响的研究,目前未见报道。本研究目的是探讨七氟醚对C57BL/6新生小鼠脑细胞凋亡的影响。材料和方法七日龄C57BL/6小鼠,雌雄不拘。随机选取同窝小鼠分入七氟醚组、酒精组、载气对照组、空气对照组和空白对照组。酒精组作为阳性对照。七氟醚组通过自制麻醉箱吸入七氟醚,以氧气作为载气,维持吸入氧浓度30%,二氧化碳浓度低于1%。通过预实验观察,超过1.7%(约0.75MAC)七氟醚会导致小鼠呼吸明显减慢,因此选择0.75MAC作为本研究的靶浓度,吸入时间为2小时。酒精组以20%酒精2.5g/kg皮下注射2次,间隔2小时。载气对照组吸入30%氧气,空气对照组置入麻醉箱中吸入空气。空白对照组不离开母鼠,以消除分离导致的应激反应。每窝分入各组后剩下的小鼠(n=11)用于血糖测定。麻醉后12小时根据实验要求,分别取材或灌流。电镜检查灌流时间为麻醉后24小时。凋亡检测方法包括激活的半胱氨酸蛋白水解酶-3(cysteine-requiring aspartate protease-3,caspase-3)免疫荧光染色和免疫印迹,DAPI染色,单链DNA抗体(single strand DNA,ssDNA)免疫荧光染色以及电镜检查确定凋亡细胞的形态。对于免疫荧光染色的结果通过DAPI染色确定总的细胞数量并计算阳性细胞率。采用Prism4.0b统计分析软件,单因素方差分析加Bonferroni post test进行各组之间凋亡阳性细胞率、条带的密度的比较。p＜0.05为差异有统计学意义。结果七氟醚麻醉后小鼠无低血糖发生。七氟醚组激活的caspase-3(activatedcaspase-3,AC3)、ssDNA阳性细胞率均明显高于载气对照组、空气对照组、空白对照组(P＜0.05)。免疫印迹结果显示七氟醚组AC3条带的密度明显高于对照组,但低于酒精组。DAPI染色显示AC3阳性细胞、ssDNA阳性细胞中较多细胞呈核浓缩,染色质聚集。电镜结果证实麻醉组小鼠大脑内较多神经元呈现凋亡细胞的典型形态,包括核固缩、细胞质浓缩等。讨论与结论Caspase-3激活是凋亡级联中的关键步骤,AC3阳性表明细胞已进入凋亡程序。单链DNA抗体可特异性识别凋亡细胞中发生聚集的染色体,比传统的原位末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediateduridine nucleotide end labeling,TUNEL)具有更高的特异性。电镜是诊断细胞凋亡形态的金标准。本研究通过这几种凋亡检测方法,证明了亚麻醉浓度(0.75MAC)七氟醚吸入可促进C57BL/6新生小鼠脑细胞凋亡。这一结论来自于动物实验,不能藉此质疑七氟醚对小儿麻醉的安全性,但提示了开展七氟醚对小儿脑发育影响的临床研究的必要性。