猪链球菌的耐药现象日趋严重,其对氟喹诺酮类药物的耐药机制主要集中于药物靶位的改变和外排泵的介导作用。本试验旨在以这两方面为切入点,重点探讨SatA和SatB外排泵在氟喹诺酮类耐药性中所起到的作用,以期为解释猪链球菌的耐药机制提供依据,具体研究内容如下：本文首先以实验室保存的临床分离猪链球菌敏感菌株和人工诱导对氟喹诺酮类抗菌药物耐药的菌株为研究对象,测定了环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星和氧氟沙星对亲本菌株和诱导菌株的最小抑菌浓度(MIC)；并测定了亲本菌株和诱导菌株的生长曲线；然后扩增和比对了诱导耐药菌株的拓扑异构酶Ⅱ(gyrA和gyrB)以及拓扑异构酶IV (parC和parE)的耐药决定区(QRDR)的基因突变；结果表明：人工诱导的9株猪链球菌菌株全部表现为对氟喹诺酮类抗菌药物耐药,MIC值分布于4-128μg/mL之间,生长曲线表明各诱导菌株的生长情况与其亲本敏感菌株相比无明显差异。部分耐药菌株不仅出现了经典的parC的Ser79Phe、gyrA的ser81Arg位点的突变,还出现了一些与文献报道一致的parE的Pro278Ser、gyrB的Asp315Asn、ser285Leu,点突变。此外,在诱导耐药菌株的gyrB基因靶位上还出现了一些不曾报道的突变和缺失,如Ser256Phe和Leu554Ser,以及288-291位的缺失。而耐药菌株JS12B与JS13B的gyrA、 gyrB、parC和parE并未发生靶位点的突变,提示猪链球菌对氟喹诺酮类抗菌药物耐药性的形成可能还有其他机制的参与。实验进一步采用联用泵抑制剂利血平测定氟喹诺酮类抗菌药物对猪链球菌的MIC值、生长抑制试验以及环丙沙星蓄积试验检测了菌株中外排泵的存在与作用情况。当联用利血平后,环丙沙星对多数耐药菌株的MIC值下降了2-16倍,暗示耐药菌中存在与环丙沙星耐药相关的外排泵；在生长抑制试验中,加入利血平后耐药菌株在含有1/4×MIC浓度的环丙沙星中生长明显受到抑制,而敏感菌株的生长基本不受利血平的影响。此外,利血平可抑制耐药菌株在不同浓度的环丙沙星(从亚抑菌浓度到抑菌浓度)中的生长,尤其存在较低浓度的环丙沙星时,这种协同抑制作用更为明显,但利血平对敏感菌株在不同浓度的环丙沙星中的生长影响不显著。而后的药物蓄积试验显示了耐药菌与敏感菌对环丙沙星的蓄积差异。在利血平与环丙沙星联用时,耐药菌蓄积的盐酸环丙沙星含量显著高于单独使用环丙沙星时的蓄积量,且耐药菌泵出盐酸环丙沙星所需的时间延长,进一步佐证了猪链球菌中存在与环丙沙星耐药相关的外排泵。通过生物信息学分析,推测猪链球菌中SatA, SatB和SmrA为具有外排功能的蛋白,可能介导猪链球菌对氟喹诺酮类药物的耐药性,因此本实验又进一步采用荧光定量的方法测定了临床分离敏感菌与人工诱导耐药菌中编码外排泵的相关基因sat A, satB以及smrA的mRNA表达水平,探讨其与环丙沙星耐药的相关性。结果显示,不含靶位点突变的菌株JS12B和JS13B与敏感菌株相比,satA和satB有92.4-421.7倍的高表达；含有靶位点突变的菌株JS14B和JS18B与敏感菌株相比,satA和satB的表达量有12.9-28.3倍差异。无论有无环丙沙星存在,耐药菌中satA和satB均存在着过表达现象,而smrA的表达量在敏感菌和耐药菌中的差异不显著。另外,环丙沙星诱导得到的耐药菌在含1/4xMIC浓度的环丙沙星中培养后,satA的表达量是不加药时的1.1-2.0倍,satB的表达量是不加药时的1.1-2.4倍；恩诺沙星诱导的耐药菌株JS18E2在1/4xMIC环丙沙星存在时,satA和satB的表达量相比较不加药时分别提高了1.76倍和1.64倍,而JS14E菌株在1/4xMIC环丙沙星存在时satA和satB的表达量分别下降了2.5倍和2.1倍,值得进一步研究。本研究结果进一步证实satA与satB的表达与猪链球菌对氟喹诺酮类药物的耐药性相关。最后,为了深入研究外排泵SatA和SatB在细菌耐药性中的功能,本实验又利用温敏自杀质粒pSET4s对satB基因进行定点敲除,以期构建satB的基因缺失株AsatB。本试验采用了氯霉素替代法以及融合PCR方法均成功地构建了缺失用自杀质粒,但是两个重组质粒电转进入猪链球菌菌株之后,都无法筛选到已经发生了同源重组的阳性缺失菌株,说明SatB对猪链球菌的生长有关键作用,因此SatB无法被人工敲除。