【摘 要】
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谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GPx）是生物体抗氧化系统中非常重要的酶类之一,主要在氧化应激方面发挥作用,能够清除H2O2防止机体生物膜氧化受损。以鱼类为敏感生物的早期预警理论已经受到国内外学者的广泛关注,多种预警系统已得到初步应用。目前已有研究应用鱼类的特定基因作为生物标志物,进行重金属污染程度的检测与评估。中华乌塘鳢（Bostrychus sinensis）
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谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GPx）是生物体抗氧化系统中非常重要的酶类之一,主要在氧化应激方面发挥作用,能够清除H2O2防止机体生物膜氧化受损。以鱼类为敏感生物的早期预警理论已经受到国内外学者的广泛关注,多种预警系统已得到初步应用。目前已有研究应用鱼类的特定基因作为生物标志物,进行重金属污染程度的检测与评估。中华乌塘鳢（Bostrychus sinensis）作为鲈形目（Perciformes）、塘鳢科（Eleotridae）、乌塘鳢属（Bostrychus）的一种广盐广温、低氧耐受性很强的鱼类,通常栖息于温水性浅海咸淡水区域。中华乌塘鳢具有促进伤口愈合的疗效,被认为是药用价值比较高的食用鱼之一,因其具有很强的耐旱能力,非常适合活体运输销售,成为了东南沿海重要的养殖对象。近年来海洋环境受到工业、农业和城市生活污水的严重污染,其中重金属污染物可以诱导氧化应激,使鱼类免疫力下降,致使海水养殖对象频有病害和死亡发生。因此研究中华乌塘鳢谷胱甘肽过氧化物酶基因对于养殖业发展和海洋生态研究都具有重要意义。本研究选择目前在鱼类中还未得到广泛研究的GPx7和GPx8基因,以实验室前期急性中毒试验得到的中华乌塘鳢镉离子96h半致死浓度(LC50)为61.44 mg/L(取LC50为60 mg/L)为依据,设置不同浓度（7.5、15、30 mg/L）,模拟环境污染物中镉离子对中华乌塘鳢的胁迫作用。利用分子生物学技术探究中华乌塘鳢GPx7和GPx8基因（分别命名为BsGPx7和BsGPx8）的序列特征,镉离子胁迫下GPx7、GPx8基因的表达模式变化及BsGPx7原核表达。主要结果如下:1.获得了BsGPx7的编码区基因序列,序列分析结果显示,BsGPx7氨基酸序列N端存在信号肽,其可能为分泌蛋白,编码一个典型的GPx家族结构域,1个抗氧化还原蛋白结构域和2个半胱氨酸(Cys56和Cys85)催化位点。同源性分析显示BsGPx7与鲈形目虾虎鱼科的物种有很高的同源性,GPx家族结构域和半胱氨酸催化位点在物种进化中高度保守。RT-PCR结果显示,BsGPx7基因在中华乌塘鳢组织中广泛存在,其中肝脏的表达量最高。不同浓度的镉离子胁迫下,BsGPx7基因在肝脏、头肾、脾脏、鳃和皮肤中的表达量在不同时间点出现显著上调（P＜0.05）。2.获得了BsGPx8的编码区基因序列,序列分析显示,BsGPx8无信号肽,推测其可能为胞内蛋白,编码一个N端跨膜螺旋区和GPx家族结构域,1个抗氧化还原蛋白结构域和1个保守的半胱氨酸残基(Cys109)催化位点。BsGPx8与鲈形目虾虎鱼科的物种有很高的同源性,GPx家族结构域和半胱氨酸催化位点在物种进化中高度保守。RT-PCR结果显示,BsGPx8基因在中华乌塘鳢组织中呈泛在性表达,其中肝脏的表达量最高。不同浓度的镉离子胁迫下,BsGPx8基因在肝脏、鳃和皮肤中的表达量均显著上调（P＜0.05）。3.成功构建了BsGPx7的重组表达载体p ET-28b（+）,通过原核表达获得了r BsGPx7,确定了诱导表达的最佳条件为E.coli BL21细胞,1m M的IPTG在37℃条件下诱导4 h。通过大规模培养和蛋白纯化,获得了高纯度的r BsGPx7。研究了不同温度和p H条件对r BsGPx7酶活性的影响,结果表明r BsGPx7在35°C和p H为8的条件下,酶活性最高。综上,本研究认为BsGPx7与BsGPx8具有发挥抗氧化功能的结构,参与了机体对抗镉离子诱导的氧化应激的过程,可能在抗氧化防御中起一定作用。
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