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红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)是一种重要的经济鱼类,然而,水环境中存在的大量细菌和病毒使鱼类的皮肤和黏膜不断受到侵袭,这些病原微生物侵入鱼体后会使鱼体发生病变甚至死亡,给红鳍东方鲀的大规模养殖造成严重损失。细胞因子能够调节免疫应答,是一类具有生物学活性的小分子蛋白。干扰素具有抗病毒、调节细胞生长及分化等功能,趋化因子对白细胞具有趋化作用,在炎症反应中发挥着重要作用。本实验提取了红鳍东方鲀头肾组织的总RNA,并以其为模板进行RT-PCR扩增干扰素γ(IFNγ)和趋化因19(CCL19)成熟肽的基因序列。将扩增得到的基因片段与克隆载体p MD19-T相连,测序结果表明成功克隆到了红鳍东方鲀IFNγ和CCL19的基因序列。对IFNγ和CCL19的氨基酸序列进行生物信息学分析,结果表明,IFNγ蛋白具有22个氨基酸组成的信号肽,与绿河鲀IFNγ相似性为62%,亲缘关系最近。红鳍东方鲀CCL19蛋白具有26个氨基酸组成的信号肽,与大黄鱼CCL19相似性为63%,亲缘关系最近。对IFNγ和CCL19基因进行NcoⅠ/XhoⅠ双酶切后与表达载体PET-32a(+)相连,成功构建了表达载体PET-32a(+)-IFNγ和PET-32a(+)-CCL19。将其转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞后用IPTG成功诱导表达出大小为37.835KDa和28.375KDa的目的融合蛋白。探索两种目的蛋白的最佳表达条件发现,IFNγ在IPTG浓度为1 mmol/L,37℃诱导6h时目的蛋白表达量最大,CCL19在IPTG浓度为0.5mmol/L,37℃诱导4h时目的蛋白表达量最大。用Ni-NTA柱纯化融合表达的目的蛋白,并用SDS-PAGE凝胶电泳和Western Blotting检测表明纯化获得了较高纯度的红鳍东方鲀IFNγ和CCL19融合蛋白。利用本实验室已构建好的红鳍东方鲀IL15原核表达载体诱导表达并纯化得到IL15融合蛋白,蛋白浓度为294.6μg/ml。用MTT法对该蛋白进行活性鉴定表明,加入稀释10倍和100倍的重组红鳍东方鲀IL15蛋白时CTLL-2细胞的增值率最高,分别为71%和73%,表明重组红鳍东方鲀IL15具有明显的体外促进CTLL-2细胞增值的能力。