血吸虫病是一个严重的全球性公共卫牛问题，在非洲、中东、南美洲和东南亚流行地区，超过6亿人口受到共计6种血吸虫感染的威胁，超过2亿人口被感染，预计每年至少2万人死于血吸虫病。我国主要流行日本血吸虫病，至2005年底，尚有七个省、市、自治区的105个县流行日本血吸虫病，血吸虫患者仍高居798，762例；历史上无螺区和一些基本消灭血吸虫病的地区，疫情出现反弹，血吸虫病患者及钉螺面积均有回升趋势，我国现阶段血吸虫病防治任务仍异常艰巨。半个世纪以来，经过众多研究者的不懈努力，我国血吸虫病防治取得了举世瞩目的成就，但对血吸虫病的早期诊断、有效疫苗研制及吡喹酮替代药物开发等方面仍未取得实质性突破，我国血吸虫病防治形势不容乐观，彻底消灭血吸虫仍尚待时日。因此有必要在总结前人研究经验的基础上，从新角度出发利用新技术，寻求新的早期诊断分子、疫苗候选分子及新型治疗药物。 尾蚴是血吸虫生活史中短暂的自由生活阶段，也是感染终宿主的唯一时期。尾蚴结构简单，寿命短(1-3天)，既不摄取营养，又无细胞分裂，存活力较弱。研究表明，1)尾蚴混合抗原能作为血吸虫病的早期诊断抗原，但由于来源困难不能大规模应用，且其中有效成分仍未得到鉴定。2)紫外线致弱(减毒)尾蚴是目前诱导宿主产生最强免疫保护力的疫苗，但取材困难、不安全，且作用分子机制及有效成分尚不知晓。3)虽然吡喹酮的作用靶标仍是个“谜团”，但吡喹酮能破坏血吸虫体内钙离子的动态平衡已是不争事实，而尾蚴的主要结构头腺和钻腺中富含钙离子及钙相关蛋白。综合众多研究结果，以尾蚴为研究对象寻求血吸虫病早期诊断抗原，开发血吸虫病有效疫苗，揭示吡喹酮的药理机制及开发新型替代药物将会取得血吸虫病防治新的突破口。 基于前人研究基础，我们对日本血吸虫尾蚴特异性短程表达蛋白SjCa8进行生物信息学分析、原核载体大量重组表达、纯化与鉴定、生物活性检测、在血吸虫各期虫体表达与分布检测、抗原性分析与血吸虫病早期诊断分子价值探讨、免疫原性分析与抗血吸虫感染疫苗价值评价等方面的研究。 SjCa8的生物信息学分析 SjCa8是一个由69个氨基酸组成的小分子蛋白，理论等电点和分子量分别为5.16、7.7kD。氨基酸序列中具两段钙结合特征的EF-hand基序，分别位于氨基酸序列的15-27区、51-63区。氨基酸序列中7-14区、28-41区和43-52区为SjCa8的潜在抗原表位。对源自日本血吸虫(Sj)、曼氏血吸虫(Sm)、华支睾吸虫(Cs)、肝片形吸虫(Fh)、巴西利什曼原虫(Lb)、小鼠(Mm)和人类(Hm)的Ca8氨基酸序列进行多序列比对及种系进化树分析发现，SjCa8与寄生虫Ca8的相似性高于哺乳动物Ca8与SmCa8相似性最高(86.96％)，与MmCa8的相似性最低(30％)。纯化SjCa8的制备与鉴定SjCa8在原核载体pET32a(+)中的最佳表达条件为：诱导温度：37℃；IPTG终浓度：0.4mM；诱导时间：6h。在此条件下，SjCa8主要以可溶性蛋白形式融合表达，表达量约占菌体总蛋白量的28％。融合SjCa8经柱层析、酶切和透析冻干处理，可获得与预期大小一致的纯化SjCa8，并经MALDI-TOF/TOF-MS鉴定确认。 SjCa8的Ca<2+>结合活性检测经EMSA分析，重组表达SjCa8具有良好生物活性，具有钙结合能力，可用于下一步的研究。 SjCa8在血吸虫生活史不同虫期中的表达RT-PCR及Western-blot均证明，SjCa8特异性表达于血吸虫尾蚴阶段，在雄性成虫、雌性成虫及虫卵中未见表达；进一步的研究发现，SjCa8只能在逸出钉螺3h内的尾蚴中检测到，说明SjCa8是尾蚴特异性短程表达蛋白。 SjCa8在尾蚴中的组织定位免疫荧光检测尾蚴虫体、组织冰冻切片发现，SjCa8主要分布于血吸虫尾蚴的头腺和钻腺中，其他部分未有明显分布。预示SjCa8与尾蚴头腺、钻腺的功能密切相关，即在尾蚴寻找宿主、吸附宿主皮肤、入侵宿主皮肤及侵入皮肤过程中尾蚴体膜修复等生命活动中扮演重要角色。 SjCa8的抗原性及其血吸虫病早期免疫诊断价值探讨SjCa8属于尾蚴特异性短程表达蛋白，但在血吸虫感染初期，宿主体内并不能检测到相应特异性抗体，而且，以SjCa8诊断血吸虫感染、肝吸虫感染、弓形虫感染及广州管圆线虫感染时出现不同程度的交叉反应，显示SjCa8并非血吸虫病早期免疫诊断的理想候选分子。 SjCa8的免疫原性及其抗血吸虫感染作用的考核利用SjCa8免疫Balb/c小鼠2-3次，可在小鼠体内检测到滴度高达1：2000的特异性抗体，证实SjCa8具有较好的免疫原性。动物保护性试验显示：SjCa8免疫后可诱导小鼠获得35.31％的减虫率和35.68％的肝减卵率，SjCa8具有抗血吸虫感染疫苗开发的广阔前景。经SjCa8处理的髓源性树突状细胞(BMDC)，CD40、CD80、CD86、MHC Ⅱ类分子表达水平显著升高，CD11c的表达未见明显变化，表明SjCa8能有效促进BMDC的分化成熟，从而可以进一步激活机体特异性T细胞免疫反应。综上所述，我们成功表达并纯化了具有钙结合活性的SjCa8，研究证实SjCa8为逸出钉螺3h内尾蚴特异性短程表达蛋白，分布于尾蚴头腺、钻腺中；SjCa8应用于血吸虫病早期诊断的价值不大，但可作为抗血吸虫感染疫苗的新的候选分子。SjCa8的短程特异性表达的机制与生物学意义，SjCa8诱导宿主较高免疫保护力的分子机制及其是否为吡喹酮(或其他替代新药)的作用靶标尚需进一步研究。