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目的:制备包含乳腺癌新抗原表位的活性肽段,为进一步制备其单克隆抗体与建立新的乳腺癌诊断方法奠定基础;研究巯基乙酸(TGA)修饰的CdTe量子点对PCR反应特异性的影响;初步调查不同粒径的纳米金粒子对RTS(rapid translation system)系统效率的影响。
方法:根据brcaa1基因序列与RTS技术要求,设计并合成带有His尾巴的PCR引物,利用brcaa1基因质粒作模板,利用PCR技术扩增获取相应基因片段并测序证实,然后采用RTS系统试剂盒与配套设备,快速翻译合成蛋白,利用SDS-PAGE电泳与Western Blot技术,鉴定表达蛋白的活性。把巯基乙酸修饰的CdTe量子点加入到PCR反应液中,使用brcaa1基因质粒作为PCR反应的模板,进行两轮PCR扩增反应。最终的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳分析。加入不同量不同粒径的金粒子后进行RTS实验,用ND1000仪器进行蛋白质定量测定。
结果:PCR扩增获取包含乳腺癌新抗原表位的BRCAA1基因片段;测序证实所获片段是所需的目的片段;Western Blot分析证实表达的肽段具有抗原活性。在0mg/ml到1.33 mg/ml范围内,随着巯基乙酸修饰的量子点的量逐渐增加,非特异性的扩增条带逐渐消失,荧光(PL)光谱表明PCR反应后的量子点荧光强度降低,X射线光电子能谱(XPS)证实PCR反应前后的Cd元素和Te元素的能谱峰并没有出现化学位移,吸收光谱(UV-vis)表明了PCR反应之后的吸收强度增强。加入不同粒径的金纳米粒子进入RTS系统中,对于5nm金粒子,在加入1.2nM(1μl)时使蛋白产量达到最大值,继续增大加入量则使合成蛋白质减少,对于10nm和20nm的金粒子,蛋白产量随其加入量的增多而下降。
结论:制备了具有生物活性包含乳腺癌新抗原表位的BRCAA1肽段,为进一步制备单克隆抗体与建立诊断方法奠定了基础。在PCR反应液中,加入1.33 mg/ml浓度内的巯基乙酸修饰的CdTe量子点,可显著增强PCR的特异性,此现象可以应用于超灵敏DNA检测、光电生物传感器。在RTS系统中,加入1.2nM范围内的5nm直径的金纳米粒子可以使蛋白产量显著增加。