研究背景:腰椎间盘退行性病变是腰椎自然老化、退化的病理过程,是脊柱外科比较常见的疾病之一。腰部疾病腰椎间盘突出症(lumbar disc herniation,LDH)是临床上最为常见的疾病。LDH因年龄、性别、患病时间以及部位的差异,其临床表现与临床症状也不尽相同,根据其临床表现可归为腰痛、痹症等中医学范畴。近几年来该病呈上升趋势发展,且发病趋势有逐渐由中老年人群向青壮年人群扩展的趋势,腰椎间盘退变是腰椎退行性疾病的病理基础,腰椎退行性疾病表现为椎间盘细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的降解、椎间盘细胞减少;腰椎间盘的力学性能发生改变的原因是细胞外基质降解,从而诱发腰椎间盘的突出、脱出,进一步引起相应的体征和临床症状。迄今为止,医学界对于椎间盘退行性变的原因的认识尚不完全清楚,能确定的是其因素包括多种,如遗传性、细胞因子表达异常、患者年龄特征变化、基质金属蛋白酶(matrixmetall oproteinases,MMPs)活性异常增高、生物力学改变等因素,都参与了椎间盘的退变过程。被认为在椎间盘退变过程中起着关键性作用的是MMPs活性的异常增高。它能够减少细胞外基膜组分的作用。自发现第一种MMPs以来,到目前共在MMPs家族中分离出来28个成员,发现的MMPs家族成员按被发现的顺序进行命名,分别命名为MMP-1~MMP-28。正常的人体椎间盘组织中,含有少量的MMPs和MMPs抑制剂(TIMPs),MMPs与TIMPs之间的表达存在一定比例关系,他们共同维持ECM的合成与降解的平衡状态。在退变椎间盘组织中,MMP-3和MMP-9受细胞因子以及自身调节等多因素的调节,活性表达显著增高,因而这两个MMPs家族成员被认为是腰椎间盘组织退变中的重要酶类,与椎间盘组织的退变有密切的关系。在椎间盘退变的检查诊断中,核磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)是最主要的影像学检查方法,目前该检查诊断方法在临床上的应用非常广泛。在椎间盘退变的分级标准中,Pfirrmann分级标准是脊柱外科医师共同认可的椎间盘退变分级标准。目前,学术界还尚未出现关于MMPs在不同椎间盘退变的Pfirrmann分级表达中的相关研究。研究目的:基于以上背景,本文研究的目的在于:1)通过检测MMP-3和MMP-9在正常或异常椎间盘髓核组织中的表达情况,观察其表达是否存在差异;2)通过检测MMP-3和MMP-9在正常或异常椎间盘髓核组织中的表达情况,分析探讨二者之间的存在的相关性;3)按照被认可的Pfirrmann分级标准对椎间盘退变进行分级,观察Pfirrmann分级标准下不同分级的椎间盘退变的MMP-3、MMP-9表达是否存在差异,如果存在差异,分析具体差异情况及原因。方法:选取郑州大学第一附属医院骨五科2013年06月~2013年12月期间收治的腰椎间盘突出症患者46例,取其髓核标本为退变组。46例髓核标本中,来自男性患者的21例,来自女性患者的25例,患者年龄在30~62岁之间,平均年龄为(42.6±2.2)岁,其中2例为L2/L3,3例为L3/L4,18例为L4/L5,23例为L5/S1。退变组所有患者依据MRI检查结果,以腰椎间盘突出的类型进一步分组,其中23例突出型的归为突出组,16例脱出型的归为脱出组,7例游离型的归为游离组。另选择同期因腰椎骨折在我院本科室接受治疗的12例患者的正常腰椎间盘髓核组织标本为对照组。12例腰椎间盘髓核组织标本来源于男性的7例,来源于女性的5例,年龄在年龄17~36岁之间,平均年龄为(26.8±1.8)岁,其中6例为L1/L2,4例为L2/L3,2例为L3/L4。退变组与对照组两组患者的髓核组织均由同一组手术医师在术中取出,取出后用生理盐水清洗干净置于甲醛溶液(浓度为10%)中浸泡,浸泡时间为24h,浸泡后送病理科脱水、浸蜡、固定、切片等常规处理,将髓核组织标本制成切片(每个髓核组织标本做成6张切片,每个切片厚度为5μm),切片置于0~4℃冰箱内保存备用。取备制好的切片行HE染色,观察两组标本的形态学差异,并根据Pfirrmann分级标准进行分级,并利用鼠抗人MMP-3和MMP-9单克隆抗体,采用免疫组化方法检测两组标本的椎间盘组织中表达情况并比较分析。阳性表达指征为细胞浆内检测出棕黄色或黄色颗粒。结果:1.对照组(正常腰椎间盘髓核组织):切片可见细胞外基质中有软骨细胞和髓核细胞散在分布,细胞轮廓清晰,包膜结构完整性好,细胞形态多为多角形或短梭形两种,胞浆呈均匀分布,细胞核多表现为蓝紫色,且数量较多,软骨陷窝中分布的数量较多,周围胶原呈红色,整体上看排列整齐规则,呈现出网状结构。退变组(腰椎间盘突出症患者的腰椎间盘髓核组织):切片显示软骨细胞和髓核细胞呈均匀状分布,较少数量的细胞分布于软骨陷窝中,形态多为梭形,且轮廓不十分清晰,线粒体在细胞内数量较少,而溶酶体聚集明显,周围胶原组织排列不整齐,为红色,整体上呈现出空泡样构造。2.免疫组化检测HE染色结果:对照组和退变组腰椎间盘髓核组织中MMP-3和MMP-9都分布于细胞浆内,免疫组化检测显示为阳性的腰椎间盘髓核组织中的MMP-3和MMP-9在显微镜下观察,细胞核呈淡蓝色,而软骨细胞胞浆内可见棕褐色或棕黄色颗粒。2.1、对照组髓核组织细胞中MMP-3的阳性表达率为(6.76±2.32)%,突出组为(27.85±7.52)%,脱出组为(61.64±9.74)%,游离组为(76.52±6.72)%,可见退变组髓核组织细胞中MMP-3的阳性表达率显著高于对照组,且差异有明显的统计学意义(P<0.05),且退变组各子组中(不同的分型中)髓核组织细胞中MMP-3的阳性表达率也具有明显的统计学差异(P<0.05)。2.2、对照组髓核组织细胞中MMP-9的阳性表达率为(7.74±2.36)%,突出组为(45.06±4.43)%,脱出组为(81.43±3.41)%,游离组为(84.35±4.34)%。可见退变组髓核组织细胞中MMP-9的阳性表达率显著高于对照组,且差异有明显的统计学意义(P<0.05),而脱出组与游离组髓核组织细胞中MMP-9的阳性表达率相比,差异无明显的统计学意义(P>0.05)。2.3、在Pfirrmann分级标准下分为II级的髓核组织细胞中,MMP-3的阳性表达率为(8.78±2.62)%,III的为(33.47±6.79)%,IV的为(51.24±10.59)%,V级为(66.73±9.84)%,可见在Pfirrmann分级标准下,不同级别之间的MMP-3的阳性表达率比较差异有明显的统计学意义(P<0.05)。2.4、在Pfirrmann分级标准下分为II级的髓核组织细胞中,MMP-9的阳性表达率为(10.53±3.43)%,III级的为(52.47±10.42)%,IV级的为(67.46±9.64)%,V级的为(83.36±6.68)%,可见在Pfirrmann分级标准下,不同级别之间的MMP-9的阳性表达率比较差异有明显的统计学意义(P<0.05)。2.5、经Pearson相关性分析结果显示,退变组髓核组织细胞中MMP-3的阳性表达与髓核组织细胞中MMP-9的阳性表达呈正相关(0<r<1)。结论:1.在退变的椎间盘髓核组织中MMP-3、MMP-9的阳性表达显著高于正常的椎间盘组织中MMP-3、MMP-9的阳性表达,MMP-3和MMP-9在腰椎间盘组织中表达的变化可能参与了腰椎间盘组织的退变的过程。2.MMP-3和MMP-9在退变的腰椎间盘髓核组织中成明确的正相关性,推测MMP-9可能参与了MMP-3活化过程。3.在Pfirrmann分级中,不同级别的腰椎间盘退化中MMP-3、MMP-9的阳性表达差异明显,证实二者能够反映椎间盘的退变进程。