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第一部分miRNA-29b-3p靶向抑制MMP2的表达参与动脉钙化的调控目的:探讨miRNA-29b-3p对MMP2表达和动脉钙化的影响。材料和方法:20只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、钙化模型组,每组各10只。钙化模型组采用大剂量维生素D3 60万U/kg/天在大鼠背部皮下注射诱导钙化,正常对照组在大鼠背部皮下注射等剂量生理盐水,连续3天。10天后处死全部大鼠,立即分离大鼠胸腹主动脉,部分置于4%多聚甲醛保存,用于制作动脉组织病理切片,部分保存于液氮。苏木精-伊红(HE)染色观察两组大鼠动脉组织病理切片组织结构变化,钙盐(Von Kossa)染色观察两组大鼠动脉组织病理切片钙盐沉积情况。运用miRNA-29b-3p mimics和inhibitors瞬时转染A7R5大鼠血管平滑肌细胞系过表达和沉默miRNA-29b-3p。q RT-PCR和Western Blot分别检测动脉组织和细胞中miRNA-29b-3p、MMP2 m RNA和蛋白表达水平。Pearson相关系数法分析miRNA-29b-3p与动脉组织中MMP2 m RNA和蛋白表达水平的相关性。应用生物信息学预测miRNA-29b-3p靶基因。双荧光素酶报告基因实验检测miRNA-29b-3p对MMP2表达的直接影响。结果:HE染色结果显示:钙化模型组主动脉壁结构破坏、弹性纤维降解、排列紊乱,正常对照组主动脉壁结构完整。Von Kossa染色结果显示:钙化模型组主动脉中层沿着弹性纤维出现明显的黑色钙盐沉积,正常对照组未见钙盐沉积。q RT-PCR结果证实钙化动脉组织中miRNA-29b-3p表达水平明显低于正常动脉组织(P=0.0035),而MMP2 m RNA表达水平明显高于正常动脉组织(P<0.0001)。Western Blot结果证实钙化动脉组织中MMP2蛋白表达水平也明显高于正常动脉组织(P<0.0001)。Pearson相关系数法结果显示动脉组织中miRNA-29b-3p与MMP2 m RNA(P=0.0014,R2=0.481)和蛋白(P=0.0026,R2=0.443)表达负相关。miRNA-29b-3p mimics和inhibitors瞬时转染结果显示miRNA-29b-3p表达增加或减少能分别减少或增加MMP2蛋白表达水平(P<0.05)。生物信息学靶基因预测显示MMP2可能是miRNA-29b-3p的靶基因。双荧光素酶报告实验证明miRNA-29b-3P对MMP2有直接调控作用。结论:1.维生素D3诱导的大鼠动脉钙化模型中miRNA-29b-3p表达降低,MMP2表达升高;2.MMP2是miRNA-29b-3p靶基因;3、miRNA-29b-3P可能通过抑制MMP2的表达参与动脉钙化的调控。第二部分miRNA-29b-3p/MMP2抑制血管平滑肌细胞向成骨细胞样分化和钙化目的:探讨miRNA-29b-3p/MMP2对血管平滑肌细胞表型转化和钙化的影响。材料和方法:应用慢病毒包装质粒PRSV、PMDLG、PMD2和miRNA-29b-3p过表达质粒或沉默质粒或空白质粒共转染293T细胞,利用细胞产生的病毒液感染大鼠VSMCs构建miRNA-29b-3p过表达和沉默的稳转株。荧光显微镜下观察质粒共转染293T细胞和病毒感染VSMCs情况。含beta-甘油磷酸钠钙化培养基诱导VSMCs钙化,分为正常组、钙化组、miRNA-29b-3p过表达组、miRNA-29b-3p沉默组、空白对照组,培养10天。VSMCs茜素红S染色和邻甲酚酞络合酮比色法检测各组VSMC钙化情况。q RT-PCR检测miRNA-29b-3p、MMP2和Runx2、Msx2 m RNA表达水平,Western Blot检测MMP2蛋白水平。结果:成功构建miRNA-29b-3p过表达和沉默的VSMCs稳转株。miRNA-29b-3p过表达和沉默后,MMP2表达分别下降和上调(p<0.05)。与钙化诱导的空白对照组相比,miRNA-29b-3p过表达的VCMCs稳转株钙含量沉积和成骨分化标志基因Runx2、Msx2表达被抑制(P<0.05),而miRNA-29b-3p沉默后增加了VSMCs钙盐沉积和Runx2、Msx2表达(P<0.05)。结论:miRNA-29b-3p/MMP2抑制beta-甘油磷酸钠钙化环境中VSMCs生骨分化和钙化。