解淀粉芽孢杆菌CC09菌株抗利福平突变及其对生物学特性和基因表达的影响

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解淀粉芽孢杆菌CC09是一株良好的生防菌,可分泌多种具有生防活性的次级代谢产物,其中环脂肽(CLPs)类抗生素的抗菌效果及环境相容性均较好,具有巨大的应用前景。但因受合成能力的限制,来源于解淀粉芽孢杆菌的CLPs至今还未应用于植物病害的防治。本文利用含利福平(Rifampin)的平板,筛选获得一系列抗利福平(Rifr)突变菌株。Rifr突变发生在rpoB基因,导致其编码的RNA聚合酶β亚基改变,从而改变RNA聚合酶全酶的转录效率,最终影响基因表达。通过研究Rifr突变对菌株生物学性状、生长及代谢特性的影响,同时筛选能在小麦上具有良好定殖能力的突变株,以期获得具有更高生防价值的菌株。主要研究成果包括:  1、共获得14株Rifr突变菌株,突变发生均编码RNA聚合酶的β亚基上,分别为H485Y、H485C、H485R、H485D、S490L、Q472R单突变和S490L/S617F双突变这7类。  2、皿内抑菌实验表明,H485R、H485D突变株(正突变菌株)对白地霉生长有很强的抑制活性,HPLC检测结果显示,这两株突变体产抗菌物质Iturin A的量显著提高,分别为野生型菌CC09产Iturin A量的2.0倍和1.7倍;而H485Y、S490L、Q472R和S490L/S617F突变株(负突变菌株)的抗菌活性则显著下降,Iturin A产量较菌株CC09分别降低18.7%、56.2%、44.2%和19.8%;此外,同为β亚基H485突变,当突变后氨基酸替换为C时不会显著影响菌株的抗菌活性和IturinA产量。  3、Rifr突变对解淀粉芽孢杆菌生物学性状的影响,具体结果如下:  (1)抗利福平突变会影响菌株的菌落特征、菌体长度、芽孢形成以及对利福平的耐受性。Rifr突变显著影响菌体长度和芽孢形成;Q472R和S490L突变显著影响菌株的菌落形态。  (2)不同的Rifr突变会显著影响菌株的运动能力、生物膜的形成及其在小麦叶际、叶内的定殖能力。S490L突变显著降低菌株的运动能力,还会大大延后生物膜的形成时间;H485突变使菌株生物膜表面产生明显的褶皱;S490L突变会导致菌株生物膜表面产生细密块状漂浮物。除S490L/S617F突变菌株与野生型菌株的小麦叶内定殖能力相近外,其余Rifr突变均会导致菌株在小麦叶际及叶内定殖能力的下降。  (3)不同的Rifr突变会显著影响菌株的营养需求和环境耐受性,改变菌株对碳源和氮源的利用率以及对环境温度、pH和NaCl浓度的耐受性。  (4)S617F突变能在菌株菌体长度、运动能力和芽孢形成等多方面补偿S490L突变对菌株的影响。  4、qPCR检测分析野生型菌CC09、正突变菌0928和负突变菌0917中与生防特性相关的14个基因在转录水平上的差异。结果表明,抗利福平突变在转录水平上影响了基因的表达,进而影响了菌株生防相关的生物学特性。
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