呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是引起婴幼儿和老年人下呼吸道疾病的重要病原体之一，其易感人群主要集中在婴幼儿，65岁以上老年人以及免疫缺陷的成年人。据统计，全球每年由RSV引起的下呼吸道感染病例超过三千万，其中10%的患者需要住院治疗，2岁以内的婴幼儿RSV感染率超过90%。同时，RSV也是造成老年人和免疫缺陷成年人住院和肺炎死亡的首要病原之一。特别需要指出的是，RSV患者由于免疫力低下，因此易发生临床混合感染。其中，与流感病毒的混合感染超过50%。由于其病情高发，致病范围广，目前已引起全世界范围的高度重视，成为全球性的公共卫生问题。疫苗是传染病防控的重要手段，而RSV的疫苗研制一直也是大家所关注的热点问题，WHO也将RSV疫苗列入全球最优先发展的疫苗之一。经过半个多世纪的研究，目前RSV疫苗研究已取得了阶段性的进展。上世纪60年代最早出现的福尔马林灭活疫苗（FI-RSV）由于在接种人群引起严重的免疫增强，最终以失败告终；根据表面糖蛋白制备的亚单位疫苗由于保护不全面，而难以成为临床可用的疫苗株；随后发展起来的减毒活疫苗及载体活疫苗虽然进入了临床实验阶段，但由于其安全性存在隐患最终未能通过认证；近年获批进入临床实验的RSV病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗多采用注射途径免疫人体，激发机体产生细胞免疫有限，保护效果仍有不足。虽有多种类型的疫苗正在研制中，但目前仍没有通过认证的RSV疫苗，因此发展安全有效RSV疫苗迫在眉睫。同时，传统的疫苗接种途径主要通过注射方式，其激发的细胞免疫应答十分有限，并且不能产生黏膜免疫反应。因此，在免疫接种途径上寻求创新也成为RSV疫苗发展的重要突破口之一。本项研究立足于RSV新型疫苗的构建，致力于解决RSV疫苗免疫后Th1/Th2不平衡、细胞免疫受限、无黏膜免疫应答等瓶颈问题。主要包括如下两方面研究工作：一是针对目前现有的VLP疫苗不能产生黏膜免疫应答的现状，开展喷鼻免疫剂型研制，为解决如何激发机体产生长效的细胞及黏膜免疫应答提供思路；二是针对目前临床上RSV与流感混合感染频发的现状，开展喷鼻RSV与流感嵌合疫苗剂型，为“一苗两用”提供方向。具体如下：重组RSV-VLPs疫苗株制备及免疫效果评价VLP是一种能够模拟病毒形态但不具有复制能力的疫苗形式，由于其能够高度富集病毒抗原，最大程度上模拟病毒天然结构，能够被宿主的免疫系统所识别，目前已成为病毒疫苗研究的发展方向。但由于RSV自身极难形成VLP结构，我们将流感的基质蛋白M1与RSV的融合蛋白（fusion protein，F）和粘附糖蛋白（attachment glycoprotein，G）进行结合，形成以流感M1蛋白为骨架，嵌合有RSV F/G蛋白的重组呼吸道合胞病毒样颗粒（RSV-VLPs），为RSV疫苗的发展提供了保证。目的：采用Bac-to-Bac昆虫表达系统表达以流感M1蛋白为骨架，嵌合有RSV F、G蛋白的RSV-VLPs候选疫苗株。经滴鼻免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠，评价其免疫原性及免疫保护效果，为新型RSV候选疫苗株提供思路。方法：采用Vector NTI AdvanceII系统进行序列优化并合成。采用基因重组技术，成功构建的穿梭质粒pFastBac Dual-M1-F/pFastBac Dual-M1-G。以重组完全的Bacmid-M1-F/Bacmid-M1-G，转染昆虫Sf9细胞，获取重组杆状病毒，并进行重组RSV-VLPs的表达。以超滤浓缩，蔗糖密度梯度离心法纯化重组RSV-VLPs疫苗抗原。滴鼻免疫小鼠后，ELISA法检测血清中IgG、IgG1、IgG2a以及鼻肺灌洗液中sIgA抗体效价，ELISPOT法检测小鼠脾细胞悬液中IFN-γ及IL-4等细胞因子分泌水平，评价候选疫苗的免疫原性。二免二周后，以RSVA2株进行攻毒，通过检测小鼠体重变化，肺病毒载量及肺病理切片评价候选疫苗的免疫保护性。结果：Western blot鉴定重组RSV-VLPs疫苗抗原中目的蛋白均有表达，电镜下观察重组RSV-VLPs疫苗抗原颗粒完整，大小均一。可认为成功制备重组RSV-VLPs疫苗抗原，分别命名为重组RSV-F VLPs疫苗株、重组RSV-G VLPs疫苗株。动物实验结果证实重组RSV-VLPs疫苗免疫小鼠后能够产生高滴度的RSV特异性抗体，且IFN-γ及IL-4等细胞因子水平较PBS对照组有明显升高(p＜0.01)。攻毒实验结果显示候选疫苗RSV-VLPs能够降低小鼠鼻肺病毒载量，减轻肺部病变。结论：利用Bac-to-Bac昆虫表达系统制备的重组RSV-VLPs疫苗株具有良好的免疫原性，能够激发机体产生以Th1型细胞为主的免疫应答，且可以有效诱导机体产生黏膜免疫反应。同时在RSVA2毒株攻击后，RSV-VLPs候选疫苗也显示出良好的免疫保护效果，为深入研究提供了实验依据。重组FLU/RSV/NA-F疫苗株制备及免疫效果评价随着反向遗传学技术的飞速发展，以及流感病毒载体的自身优势，以流感病毒作为载体的疫苗传递系统已引起广泛关注。其优势主要表现在能够产生双重免疫保护效果，安全性高，易于大规模生产且具有十分广阔的前景。目前已成功应用于Adv、HIV、TB等疫苗的研究。本研究主要采用反向遗传学技术，重配以流感病毒为载体的rFLU/RSV/NA-F减毒活疫苗株，为发展RSV新型疫苗提供新思路。目的：以冷适应流感减毒活疫苗株为载体，重配嵌合有RSV F蛋白中和抗体表位II的FLU-RSV减毒活疫苗株。滴鼻免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠，评价其免疫原性及免疫保护效果，为RSV疫苗研制提供新方向。方法：采用反向遗传学技术，对冷适应流感减毒活疫苗株NA基因进行改造，将RSV F蛋白抗原表位II插入NA序列中，形成重组NA-F片段，同冷适应流感减毒活疫苗株其余七片段PB1、PB2、PA、HA、NA、NP和M进行重配，对重组FLU-RSV疫苗株进行拯救。通过血凝实验、Western blot、透射电镜等方法对其进行全面鉴定。同时测定其在体内、体外的生长复制情况。对重组FLU-RSV疫苗进行浓缩纯化，滴鼻免疫小鼠后，ELISA法检测血清中IgG、IgG1、IgG2a以及鼻肺灌洗液中sIgA抗体效价，ELISPOT法检测小鼠脾细胞悬液中IFN-γ及IL-4等细胞因子分泌水平，评价重组FLU-RSV疫苗株的免疫原性。二免二周后，以RSV A2株进行攻毒，通过检测小鼠体重变化，肺病毒载量及肺病理切片评价重组FLU-RSV疫苗株的免疫保护性。结果：成功制备重组FLU-RSV疫苗株，并证实其在鸡胚中可稳定传代，且RSV F蛋白能够稳定表达，电镜下观察重组病毒形态完整，大小分布符合流感病毒粒子特征，证实重组FLU-RSV疫苗株拯救成功，命名为rFLU/RSV/NA-F。体内体外复制情况测定结果显示rFLU/RSV/NA-F疫苗株与H1N1冷适应减毒疫苗株复制情况基本一致，最适生长温度均为33℃。动物实验证实rFLU/RSV/NA-F疫苗株能够诱导小鼠体内产生RSV特异性的Th1型细胞免疫应答，同时有效激发机体产生黏膜免疫反应，证实rFLU/RSV/NA-F疫苗株具有良好的免疫原性。攻毒实验显示rFLU/RSV/NA-F疫苗株可以降低免疫组肺组织病毒载量，改善肺水肿、出血等炎症表现，可以对免疫小鼠产生一定的保护效果。结论：采用反向遗传学对rFLU/RSV/NA-F疫苗株进行拯救，并对疫苗株进行扩增纯化后，滴鼻免疫小鼠，证实rFLU/RSV/NA-F疫苗株具有良好的免疫原性，在诱导机体产生免疫应答的同时有效避免了Th1/Th2不平衡问题。攻毒实验证实rFLU/RSV/NA-F疫苗株具有显著的保护效果，能有效抵抗RSV病毒的感染。为新型RSV疫苗的发展提供新思路的同时，也为实现“一苗两用”提供实验依据。