论文部分内容阅读
目的：由于淋病奈瑟菌的高变异性和高感染率，淋病已经成为全球性公共卫生问题之一，简便快速诊断是控制其广泛转播的重要手段。本研究的主要目的是制备抗淋病奈瑟菌隐蔽性质粒蛋白B(CppB蛋白)的单克隆抗体，并建立一种基于荧光微球的免疫层析试纸条快速检测淋球菌感染。
方法：筛选并收集广东省皮肤病医院2017年微生物室分离的115株淋病奈瑟菌和93株非淋球菌，共16种常见致病菌，并经qRT-PCR验证淋球菌cppB基因的广谱性和特异性。以酶切酶连的方式构建重组质粒pGEX-6P-1-cppB，并通过PCR和DNA测序验证重组质粒。以大肠杆菌原核表达系统表达GST-CppB融合蛋白，使用GST-SefinoseTM试剂盒获得纯化的GST-CppB融合蛋白，并通过SDS-PAGE和WesternBlot验证融合蛋白。将纯化的GST-CppB融合蛋白免疫雌性BALb/c小鼠，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体，并通过间接ELISA测定单克隆抗体的亚型和效价，通过WesternBlot鉴定单克隆抗体的反应性和特异性。以单克隆抗体为检测抗体，喷涂多克隆抗体(兔源)为检测线(T线)，喷涂羊抗鼠IgG为质控线(C线)，建立基于荧光微球为信号的免疫层析试纸条，并验证试纸条的灵敏度、特异性和稳定性。
结果：qRT-PCR检测淋病奈瑟菌cppB基因的阳性率为96.52%(111/115)，特异性为100%，证明cppB基于普遍存在于淋球菌中，而不存在于其他常见致病菌(0/93)。PCR扩增证明成功构建了重组质粒pGEX-6P-1-cppB，DNA测序后比对证明插入pGEX-6P-1质粒中的cppB基因与GeneBank公布的cppB基因序列(FMSZ01000040.1)完全一致。SDS-PAGE染色结果表明，经诱导后的重组宿主能够大量表达GST-CppB融合蛋白，WesternBlot(以GST抗体为一抗)结果与SDS-PAGE的结果一致。纯化后的GST-CppB融合蛋白经染色后证明，已获得纯度较高的GST-CppB蛋白。通过杂交瘤技术获得4种单克隆细胞株，其亚型分别为2株IgG1(F11，G3)，1株IgG2a(C11)，1株IgG2b(E1)，所有单抗的效价均大于1∶64000，其中MAb-E1的效价最高。WesternBlot结果显示，MAb-F11对淋病奈瑟菌的反应性最好，阳性率可达87.83%(101/115)，特异性为100%，与qRT-PCR验证cppB基因的结果就有一致性。另外，我们发现了CppB的突变体，命名为CppB-2。与正常序列相比，CppB-2基因缺失54bp，位于429-482，导致CppB-2蛋白仅为21.93kd，略低于CppB(23.94kd)。荧光微球免疫层析试纸条检测CppB蛋白的灵敏度为20ng/ml，检测淋病奈瑟菌的灵敏度为1x105CFU/ml，且试纸条的阳性率为82.61%(95/115)。与WesternBlot结果一致的是，常见的致病菌在免疫层析试纸条上均为阴性，表明试纸条也具有高特异性。
结论：CppB蛋白在淋病奈瑟菌中普遍存在，可作为区分淋球菌和其他常见致病菌的靶标，基于CppB蛋白的单克隆抗体制备的免疫层析试纸条，有望成为筛查淋病的重要工具，但敏感性尚待提高。
方法：筛选并收集广东省皮肤病医院2017年微生物室分离的115株淋病奈瑟菌和93株非淋球菌，共16种常见致病菌，并经qRT-PCR验证淋球菌cppB基因的广谱性和特异性。以酶切酶连的方式构建重组质粒pGEX-6P-1-cppB，并通过PCR和DNA测序验证重组质粒。以大肠杆菌原核表达系统表达GST-CppB融合蛋白，使用GST-SefinoseTM试剂盒获得纯化的GST-CppB融合蛋白，并通过SDS-PAGE和WesternBlot验证融合蛋白。将纯化的GST-CppB融合蛋白免疫雌性BALb/c小鼠，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体，并通过间接ELISA测定单克隆抗体的亚型和效价，通过WesternBlot鉴定单克隆抗体的反应性和特异性。以单克隆抗体为检测抗体，喷涂多克隆抗体(兔源)为检测线(T线)，喷涂羊抗鼠IgG为质控线(C线)，建立基于荧光微球为信号的免疫层析试纸条，并验证试纸条的灵敏度、特异性和稳定性。
结果：qRT-PCR检测淋病奈瑟菌cppB基因的阳性率为96.52%(111/115)，特异性为100%，证明cppB基于普遍存在于淋球菌中，而不存在于其他常见致病菌(0/93)。PCR扩增证明成功构建了重组质粒pGEX-6P-1-cppB，DNA测序后比对证明插入pGEX-6P-1质粒中的cppB基因与GeneBank公布的cppB基因序列(FMSZ01000040.1)完全一致。SDS-PAGE染色结果表明，经诱导后的重组宿主能够大量表达GST-CppB融合蛋白，WesternBlot(以GST抗体为一抗)结果与SDS-PAGE的结果一致。纯化后的GST-CppB融合蛋白经染色后证明，已获得纯度较高的GST-CppB蛋白。通过杂交瘤技术获得4种单克隆细胞株，其亚型分别为2株IgG1(F11，G3)，1株IgG2a(C11)，1株IgG2b(E1)，所有单抗的效价均大于1∶64000，其中MAb-E1的效价最高。WesternBlot结果显示，MAb-F11对淋病奈瑟菌的反应性最好，阳性率可达87.83%(101/115)，特异性为100%，与qRT-PCR验证cppB基因的结果就有一致性。另外，我们发现了CppB的突变体，命名为CppB-2。与正常序列相比，CppB-2基因缺失54bp，位于429-482，导致CppB-2蛋白仅为21.93kd，略低于CppB(23.94kd)。荧光微球免疫层析试纸条检测CppB蛋白的灵敏度为20ng/ml，检测淋病奈瑟菌的灵敏度为1x105CFU/ml，且试纸条的阳性率为82.61%(95/115)。与WesternBlot结果一致的是，常见的致病菌在免疫层析试纸条上均为阴性，表明试纸条也具有高特异性。
结论：CppB蛋白在淋病奈瑟菌中普遍存在，可作为区分淋球菌和其他常见致病菌的靶标，基于CppB蛋白的单克隆抗体制备的免疫层析试纸条，有望成为筛查淋病的重要工具，但敏感性尚待提高。