乙型肝炎严重威胁人类健康，临床表型千差万别，从无症状感染以致清除病毒到持续性感染最终发展为肝硬化、肝功能衰竭或肝细胞癌，形成了复杂的疾病谱。而对于其致病机制目前尚无定论，普遍认为主要有宿主、病毒、环境三方面因素参与。广义上的病毒变异包括在不同宿主体内病毒株的差异即基因型的不同以及机体内病毒的变异。当机体内变异株逐渐累积，就形成感染者体内病毒遗传异质性(genetic heterogeneity)，称为准种(quasispecies)。近来已有一些研究支持准种假说，最近的研究表明，HBV具有的准种特性可能是引起乙型肝炎慢性化和抗病毒治疗失败的一个非常重要的病毒学因素。宿主遗传因素在决定HBV易感性和感染后疾病的表型中起着重要作用。人类基因组研究为鉴定疾病易感和抗性基因提供了可喜的前景。主要研究方法是：① 根据基因编码产物的作用定向克隆。② 利用动物模型或已发现的疾病相关基因确定所要研究疾病的同源基因。③ 全基因组扫描，即微卫星和单核苷酸多态性分析。目前主要采用的研究对象包括孪生子、无亲缘关系的养子间、家系、种族和大量人群调查。孪生子作为很好的研究模型，已被广泛用于研究疾病复杂性状的影响因素中遗传和环境因素的相对作用。临床资料表明，HBV的母婴传播中孪生子HBV感染率明显高于非孪生子女，这就形成了具有相似遗传背景的两人同时感染相同病毒的绝妙现象，且HBV感染孪生子的表型往往都是相同的，符合反应时间遗传学(reaction-time genetics)的规律。对MZ孪生子之间或DZ孪生子之间配对研究，在感染相同或不同HBV毒株的情况下，可进行宿主遗传因素、宿主免疫应答、病毒基因变异、环境因素及临床表型等多变量分析，从而揭示遗传因素及其决定的免疫反应以及在免疫压力下的病毒变异对疾病易感及转归的影响。研究表明宿主遗传因素和病毒因素在决定疾病表型中可能起作用。而关于乙型肝炎孪生子和非孪生子准种特性的研究近年来未见报道，所以本研究以此为出发点，进行研究设计，以HBV感染孪生子及非孪生子为研究对象，初步探讨相同或不同遗传背景下宿主体内HBV preS1/S2区准种特性及其与临床表型之间的关系。人类基因组STR多态性扫描(Genescan)技术鉴定孪生子卵型，为孪生子研究奠定了遗传基础。对所收集的20<WP=9>对HBV感染孪生子血清标本，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术进行HAV、HBV、HCV、HDV、HEV血清标志物检测，以明确血清学模式并除外其他肝炎病毒的合并感染。采用Lightcycler荧光定量检测系统进行HBV DNA定量检测，同时检测ALT、AST、TBIL等肝功指标。通过对HBV感染MZ和DZ之间血清学模式，感染率、同病率、临床表型一致性、各相关血清学标志物的比率的分析，以初步了解宿主遗传因素在影响乙型肝炎临床表型中的作用。对所选择的6例HBV高水平复制的患者(1对MZ，1对DZ和1对非孪生子)采用LPCR HBV 3.2kb 全基因组DNA扩增-TA克隆-HBV preS1/S2区准种检测-核酸序列分析的实验流程，了解其HBV preS1/S2区准种特性，综合分析宿主与病毒因素在决定HBV感染后的临床表型中所起的作用。主要结果如下：一、卵型鉴定结果显示，在所研究的20对HBV感染孪生子中，有14对MZ和6对DZ，MZ均为同性别孪生子。以28个STR等位基因位点进行卵型鉴定的可信度>99.99999999%。二、MZ组两位患者分别为HBV基因型B型和基因型C型感染；提示感染来源不一致。DZ组两位患者同为HBV基因型B型感染；非孪生子组两位患者同为HBV基因型C型感染。三、成功对HBV感染孪生子和非孪生子体内病毒进行了HBV 3.2kb全基因组DNA的扩增及克隆，为今后有关HBV基因组全序列的研究提供了基础和工具。四、MZ与DZ之间感染率、HBsAg阳性率、HBeAg阳性率、无症状携带者(AsC)及病毒清除比率无显著差异(P>0.05)，而同病率、疾病表型一致率、血清学模式相同者比率有着显著差异(P<0.05)。本研究还发现有两对HBV感染孪生子(均为MZ)，均为孪生子之一因为慢性重型乙型肝炎合并严重的并发症死亡，而另一方却是慢性乙型肝炎。另有三对HBV感染MZ自然病程相似，同时行抗病毒治疗，治疗相同的时间后出现疾病表型不一致。这表明在决定HBV易感性及疾病表型的各因素中，除遗传因素之外，病毒、环境、药物等因素往往共同作用使疾病的表型发生改变。五、以HBV感染孪生子和非孪生子(共6位患者)为研究对象，进行改良CSGE和测序分析，结果显示患者体内病毒准种复杂性不高，遗传差异性介于0.0～3.3%，符合准种的定义。但在核酸和氨基酸序列上，均发生较多变异，有个别明显高变异位点。核酸变异包括碱基突变与缺失，另外发现5个C基因型克隆在nt3031-3215有185bp的大片段缺失，该缺失变异并不导致HBV基因型的改变。此外，MZ组为不同HBV基因型的感染，临床表型也不一致；而DZ组和非孪生子组，均同为相同基因型病毒感染，临床表型一致，这种现象表明可能病毒因素在影响疾病表型中起作用，似乎宿主因素的作用不大。另外也可能是DZ两位患者由于年龄较小，处于免疫耐受期，导<WP=10>致免疫压力对病毒变异的影响不大。上述结果表明，① 以人类基因组STR多态性扫描技术成功鉴定了HBV感染孪生子的卵型，为采用孪生