论文部分内容阅读
目的:自噬可能参与牙周炎的发生、发展过程,然而在糖尿病伴牙周炎症微环境下,牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)发生自噬及其相关机制还不清楚。为此,本实验并以自噬发生作为研究切入点,进一步探索糖尿病与牙周炎发生、发展之间的关系。方法:获取健康者、单纯糖尿病患者、单纯慢性牙周炎患者、2型糖尿病伴牙周炎患者的牙周膜组织,采用酶解组织块法培养细胞,并用有限稀释法对所培养的细胞进行克隆化培养纯化成为PDLSCs,应用流式细胞仪检测细胞相关表型分子,并采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)(10nmol/L)及自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)(50ug/L)对每组进行药物干预。实验分组(共12组):(1)健康组(H-PDLSCs组);(2)健康+3-MA组(H-PDLSCs+3-MA组);(3)健康+Rapa组(H-PDLSCs+Rapa组);(4)单纯糖尿病组(D-PDLSCs组);(5)单纯糖尿病+3-MA组(D-PDLSCs+3-MA组);(6)单纯糖尿病+Rapa组(D-PDLSCs+Rapa组);(7)单纯牙周炎组(P-PDLSCs组);(8)单纯牙周炎+3-MA组(P-PDLSCs+3-MA组);(9)单纯牙周炎+Rapa组(P-PDLSCs+Rapa组);(10)糖尿病伴牙周炎组(DP-PDLSCs组);(11)糖尿病伴牙周炎+3-MA组(DP-PDLSCs+3-MA组);(12)糖尿病伴牙周炎+Rapa组(DP-PDLSCs+Rapa组)。采用CCK-8法对以上各组细胞的增殖能力进行检测,透射电子显微镜观察细胞自噬及细胞器破坏情况,RT-q PCR检测各组细胞自噬基因(Beclin-1、LC3Ⅱ、P62)的相对表达量。结果:1、牙周膜干细胞的分离培养:成功培养H-PDLSCs 12例,D-PDLSCs 3例,P-PDLSCs7例,DP-PDLSCs 3例,4组不同来源的PDLSCs在形态上无明显差别,均为长梭形的成纤维细胞样形态。2、牙周膜干细胞的鉴定:通过流式细胞仪对4组第3代PDLSCs相关表型分子进行鉴定,结果如下:H-PDLSCs的表型分子分别为:CD90(99.86%)、CD73(99.97%)、CD105(99.30%)、CD44(99.66%)、CD45/CD34/CD11b/CD19/HLA-DR(0.55%);D-PDLSCs的表型分子分别为:CD90(99.92%)、CD73(99.98%)、CD105(99.33%)、CD44(99.70%)、CD45/CD34/CD11b/CD19/HLA-DR(0.34%);P-PDLSCs的表型分子分别为:CD90(99.33%)、CD73(99.56%)、CD105(98.52%)、CD44(99.18%)、CD45/CD34/CD11b/CD19/HLA-DR(0.41%);DP-PDLSCs的表型分子分别为:CD90(99.83%)、CD73(99.97%)、CD105(99.29%)、CD44(99.57%)、CD45/CD34/CD11b/CD19/HLA-DR(0.04%)。实验取材于患者牙齿的根中1/3牙周膜组织,通过取材部位和表型分子鉴定结果,确认了我们实验所培养的细胞为PDLSCs。3、牙周膜干细胞增殖能力的检测:H-PDLSCs、D-PDLSCs、P-PDLSCs、DP-PDLSCs的克隆形成率分别为:39.3±1.8%、31.7±3.1%、23.5±1.2%、16.8±2.5%。与H-PDLSCs组相比,D-PDLSCs、P-PDLSCs、DP-PDLSCs克隆形成率均降低,且差异有统计学意义(P<0.05),DP-PDLSCs组克隆形成率较D-PDLSCs(P<0.05)和P-PDLSCs(P<0.05)均低,差异有统计学意义(P<0.05)。CCK-8检测结果:DP-PDLSCs增殖能力较D-PDLSCs、P-PDLSCs及H-PDLSCs降低,差异均有统计学意义(P<0.05);4组细胞(H-PDLSCs、D-PDLSCs、P-PDLSCs、DP-PDLSCs)分别加入3-MA或Rapa进行药物干预后,各组PDLSCs的增殖能力均未发生明显变化,差异均无统计学意义(P>0.05)。4、透射电子显微镜结果显示:与H-PDLSCs组相比,D-PDLSCs组、P-PDLSCs组、DP-PDLSCs组自噬小体形成的数量均增多,同时细胞内细胞器的破坏更加严重,其中DP-PDLSCs组自噬小体的数量最多;H-PDLSCs及H-PDLSCs+3-MA组未发现自噬小体,H-PDLSCs+Rapa组发现少量自噬小体的形成;与D-PDLSCs组相比,D-PDLSCs+3-MA组自噬小体的数量减少,D-PDLSCs+Rapa组自噬小体的数量未见明显增多,但细胞内见较多自噬溶酶体形成;与P-PDLSCs组相比,P-PDLSCs+3-MA组自噬小体的数量减少,P-PDLSCs+Rapa组自噬小体的数量增多;与DP-PDLSCs组相比,DP-PDLSCs+3-MA组自噬小体的数量减少,DP-PDLSCs+Rapa组自噬小体的数量增多。5、RT-q PCR结果显示:与H-PDLSCs组相比,D-PDLSCs组、P-PDLSCs组、DP-PDLSCs组相关自噬基因Beclin-1、LC3Ⅱ的表达水平依次增加(P<0.05),P62的表达水平依次降低(P<0.05);与H-PDLSCs组相比,H-PDLSCs+3-MA组自噬基因Beclin-1、LC3Ⅱ的表达水平降低(P<0.05),P62表达水平增高,但无显著性差异(P>0.05),H-PDLSCs+Rapa组自噬基因Beclin-1水平增高,但无统计学意义(P>0.05),LC3Ⅱ的表达水平增高(P<0.05),P62的表达水平降低(P<0.05);与D-PDLSCs组相比,D-PDLSCs+3-MA组自噬基因Beclin-1、LC3Ⅱ的表达均降低(P<0.05),P62的表达水平升高(P<0.05),D-PDLSCs+Rapa组Beclin-1、LC3Ⅱ的表达均增高(P<0.05),而P62的表达降低(P<0.05);与P-PDLSCs组相比,Beclin-1、LC3Ⅱ在P-PDLSCs+3-MA组中表达降低(P<0.05),而P62的表达则升高(P<0.05),Beclin-1、LC3Ⅱ在P-PDLSCs+Rapa组中表达增高(P<0.05),而P62的表达则降低(P<0.05);与DP-PDLSCs组相比,DP-PDLSCs+3-MA组自噬基因Beclin-1、LC3Ⅱ的表达均降低(P<0.05),P62的表达水平增高(P<0.05),DP-PDLSCs+Rapa组Beclin-1、LC3Ⅱ的表达均增高(P<0.05),而P62的表达则呈相反趋势(P<0.05)。结论:1、糖尿病及慢性牙周炎来源的PDLSCs在形态上与健康来源的PDLSCs无明显差别,均为长梭形的成纤维细胞样形态,均具有干细胞的特性,但增殖能力均减弱;2、3-MA及Rapa对H-PDLSCs、D-PDLSCs、P-PDLSCs、DP-PDLSCs的增殖能力无明显影响;3、2型糖尿病伴牙周炎患者的PDLSCs可能发生了过度自噬和细胞器的破坏,糖尿病及炎性环境下PDLSCs发生自噬失调,推测与2型糖尿病患者牙周破坏严重有关。